基于网络药理学探讨槲皮素治疗结核性溃疡的机制

目的基于网络药理学及分子对接方法探讨槲皮素治疗结核性溃疡的分子机制。方法通过PubChem、SwissTarget和TargetNet数据库检索槲皮素的药物靶点,结合课题组前期结核性溃疡基因测序结果,获得交集靶点。利用DAVID数据库完成交集靶点的基因本体(GO)功能富集分析和京都基因和基因组数据库(KEGG)信号通路富集分析。交集靶点经STRING数据库与Cytoscape软件分析其相互作用关系并筛选枢纽节点,采用PyMOL与AutoDock Tolls软件完成槲皮素与枢纽节点的分子对接,筛选以槲皮素为核心的药物靶点,最后构建巨噬细胞模型,对上述核心基因进行验证。结果经筛选共得到54个药物靶点,富集分析结果显示,槲皮素治疗结核性溃疡可涉及的信号通路有代谢通路、脂质与动脉粥样硬化、MAPK信号通路等,另外,ALOX5、TNF、SRC、MMP9、EGFR等基因可能是槲皮素治疗结核性溃疡的关键基因,细胞实验结果表明槲皮素干预后,M1、M2巨噬细胞SRC、EGFR表达水平显著升高,MMP9表达水平显著下降。结论槲皮素可能通过影响SRC、EGFR及MMP9表达发挥其调控巨噬细胞极化的作用。

复方五凤草液负压滴灌治疗Ⅲ-Ⅳ期压力性损伤的疗效及其作用机制

目的观察复方五凤草液负压滴灌治疗(NPWTi)Ⅲ-Ⅳ期压力性损伤(PI)的临床疗效,并初步探索其作用机制。方法(1)临床研究:选取2019年1月-2022年10月于南京市中西医结合医院瘰疬科病区及伤口护理门诊就诊的60例PI患者,随机分为生理盐水NPWTi组与复方五凤草液NPWTi组,每组30例。两组均在全身基础治疗的前提下进行NPWTi,分别于治疗前及治疗第1、2、3周拆除负压装置后统计PI愈合计分量表(PUSH)评分、创面细菌培养检出率及创面愈合时间,并用ELISA法检测创面组织血管内皮生长因子(VEGF)的含量。(2)动物实验:24只SD大鼠随机分为空白组、模型组、生理盐水NPWTi组与复方五凤草液NPWTi组,每组6只,通过局部组织缺血/再灌注损伤法建立PI大鼠模型,每天治疗结束后将负压装置拆除。分别于治疗前及治疗3、7、10 d观察各组大鼠创面形态,HE染色观察创面组织病理情况,免疫组化检测创面组织CD34阳性细胞百分比,并用ELISA法及RT-qPCR分别检测各组大鼠血液、创面组织中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、核因子-κB p65(NF-κB p65)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、精氨酸酶-1(Arg-1)、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平。结果(1)临床研究:两组均能有效降低PUSH评分和创面细菌培养检出率,缩短创面愈合时间,促进创面组织VEGF表达,复方五凤草液NPWTi组优于生理盐水NPWTi组(P<0.05)。(2)动物实验:与空白组相比,模型组大鼠创面炎症反应及组织损伤明显,CD34阳性细胞百分比,以及血液和创面组织p38 MAPK、NF-κB p65、iNOS、TNF-α水平明显升高,Arg-1、TGF-β水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,生理盐水NPWTi组与复方五凤草液NPWTi组治疗7 d后创面形态评分明显降低,组织病理学形态明显改善,CD34阳性细胞百分比明显升高,血液及创面组织p38 MAPK、NF-κB p65、iNOS、TNF-α水平明显降低,Arg-1、TGF-β水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且复方五凤草液NPWTi组优于生理盐水NPWTi组(P<0.05)。结论复方五凤草液NPWTi可有效促进PI创面的愈合,其作用机制可能是通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路的活化及表达,进而调节M1/M2巨噬细胞极化平衡。

UPLC-PDA法同时测定复方五凤草液中7种成分

目的建立UPLC-PDA法同时测定复方五凤草液(五凤草、白芨、猫爪草)中没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、金丝桃苷、槲皮素、柚皮素的含有量。方法该药物80%甲醇提取液的分析采用Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.7μm);流动相乙腈-0.1%甲酸,梯度洗脱;体积流量0.3 mL/min;柱温40℃;检测波长266 nm。结果 7种成分在各自范围内线性关系良好(r≥0.999 5),平均加样回收率96.96%~102.26%,RSD 0.65%~2.10%。结论该方法稳定准确,重复性好,可用于复方五凤草液的质量控制。

从巨噬细胞角度探讨复方五凤草液干预结核性溃疡的机制

目的:探讨复方五凤草液治疗结核性溃疡的临床疗效及对巨噬细胞极化的影响。方法:(1)临床实验。将南京市中西医结合医院145例结核性溃疡患者按随机数字表法分为观察组、对照Ⅰ组和对照Ⅱ组。3组均予以基础抗结核化学治疗的同时,观察组予以复方五凤草液,对照Ⅰ组予以康复新液,对照Ⅱ组予以异烟肼液局部外用治疗,疗程4周。分别观察3组患者创面愈合总有效率、中医证候积分、创面组织病理学形态及创面组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)的表达水平。(2)细胞实验。RAW264.7细胞在完全培养基DMEM(10%的胎牛血清,1%青-链酶素溶液)于37℃、5%CO_(2)的细胞培养箱中培养。经佛波酯(PMA)诱导后向巨噬细胞分化,分别用脂多糖(LPS)诱导成M1巨噬细胞、白细胞介素-4(IL-4)诱导成M2巨噬细胞,分别予康复新溶液、异烟肼液、复方五凤草液处理以上细胞模型36 h,收集细胞上清液并离心,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、iNOS和Arg-1的蛋白量的表达,流式细胞术(FCM)检测药物对CD86、CD206表达的影响。结果:(1)临床实验。与对照Ⅰ组[87.5%(42/48),χ^(2)=3.962,P<0.05]和对照Ⅱ组[83.3%(40/48),χ^(2)=6.162,P<0.05]比较,复方五凤草液组的总有效率[98.0%(48/49)]明显较高;治疗28 d后,与对照Ⅰ组、对照Ⅱ组比较,复方五凤草液组的中医证候积分明显降低(P<0.05),复方五凤草液组创面组织病理学形态改善更为明显;免疫组化结果显示,治疗28 d后,与对照Ⅰ组、对照Ⅱ组比较,复方五凤草液组局部病灶组织样本中的iNOS表达量明显降低(P<0.05),Arg-1表达量显著升高(P<0.05,P<0.01)。(2)细胞实验。Western blot实验结果显示,与M0组比较,LPS组中iNOS、TNF-α表达升高(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+异烟肼组、LPS+康复新液组、LPS+复方五凤草液组中iNOS、TNF-α表达下降(P<0.05);与LPS+异烟肼组比较,LPS+康复新液组、LPS+复方五凤草液组中iNOS表达下降(P<0.05,P<0.01),LPS+复方五凤草液组TNF-α水平显著下降(P<0.01);与LPS+康复新液组比较,LPS+复方五凤草液组中TNF-α表达下降(P<0.05)。与M0组比较,IL-4组中Arg-1、TGF-β表达升高(P<0.01)。与IL-4组比较,IL-4+异烟肼组、IL-4+康复新液组、IL-4+复方五凤草液组中Arg-1、TGF-β表达升高(P<0.05,P<0.01)。与IL-4+异烟肼组比较,IL-4+康复新液组、IL-4+复方五凤草液组中Arg-1、TGF-β表达升高(P<0.05,P<0.01);与IL-4+康复新液组比较,IL-4+复方五凤草液组中Arg-1、TGF-β表达升高(P<0.05,P<0.01)。流式细胞术结果显示,与M0组比较,LPS组CD86表达升高,IL-4组中CD206表达升高(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+异烟肼组、LPS+康复新液组、LPS+复方五凤草液组中CD86表达下降(P<0.01);与LPS+异烟肼组比较,LPS+康复新液组、LPS+复方五凤草液组中CD86表达下降(P<0.01);与LPS+康复新液组比较,LPS+复方五凤草液组中CD86表达下降(P<0.01)。与IL-4组比较,IL-4+异烟肼组、IL-4+康复新液组、IL-4+复方五凤草液组中CD206表达升高(P<0.01);与IL-4+异烟肼组比较,IL-4+康复新液组、IL-4+复方五凤草液组中CD206表达升高(P<0.01);与IL-4+康复新液组比较,IL-4+复方五凤草液组中CD206表达升高(P<0.05)。结论:复方五凤草液能有效促进结核性溃疡愈合,其作用机制可能是通过抑制iNOS、TNF-α、CD86的表达并促进Arg-1、TGF-β、CD206的表达,从而调控M1/M2巨噬细胞极化平衡来完成。