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Generation of conditional knockout alleles for PRL-3
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作者 Hong Yan Dong Kong +2 位作者 Xiaomei Ge Xiang Gao Xiao Han 《The Journal of Biomedical Research》 CAS 2011年第6期438-443,共6页
Phosphatase of regenerating liver-3 (PRL-3) is a member of the protein tyrosine phosphatase (PTP) superfamily and is highly expressed in cancer metastases. For better understanding of the role of PRL-3 in tumor me... Phosphatase of regenerating liver-3 (PRL-3) is a member of the protein tyrosine phosphatase (PTP) superfamily and is highly expressed in cancer metastases. For better understanding of the role of PRL-3 in tumor metastasis, we applied a rapid and efficient method for generating PRL-3 floxed mice and investigated its phenotypes. A BAC retrieval strategy was applied to construct the PRL-3 conditional gene-targeting vector. Exon 4 was selected for deletion to generate a nonfunctional prematurely terminated short peptide as it will cause a frame-shift mutation. Conditional knockout PRL-3 mice were generated by using the Cre-loxP system and were validated by Southern blot and RT-PCR analysis. Further analysis revealed the phenotype characteristics of PRL-3 knockout mice and wildtype mice. In this study, we successfully constructed the PRL-3 conditional knockout mice, which will be helpful to clarify the roles of PRL-3 and the mechanisms in tumor metastasis. 展开更多
关键词 PRL-3 conditional knockout alleles Cre recombinase tumor metastasis
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Motor neuron-specific RhoA knockout delays degeneration and promotes regeneration of dendrites in spinal ventral horn after brachial plexus injury 被引量:1
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作者 Mi Li Jiawei Xu +10 位作者 Ying Zou Jialing Lu Aiyue Ou Xinrui Ma Jiaqi Zhang Yizhou Xu Lanya Fu Jingmin Liu Xianghai Wang Libing Zhou Jiasong Guo 《Neural Regeneration Research》 SCIE CAS CSCD 2023年第12期2757-2761,共5页
Dendrites play irreplaceable roles in the nerve conduction pathway and are vulnerable to various insults.Peripheral axotomy of motor neurons results in the retraction of dendritic arbors,and the dendritic arbor can be... Dendrites play irreplaceable roles in the nerve conduction pathway and are vulnerable to various insults.Peripheral axotomy of motor neurons results in the retraction of dendritic arbors,and the dendritic arbor can be re-expanded when reinnervation is allowed.RhoA is a target that regulates the cytoskeleton and promotes neuronal survival and axon regeneration.However,the role of RhoA in dendrite degeneration and regeneration is unknown.In this study,we explored the potential role of RhoA in dendrites.A line of motor neuronal conditional knockout mice was developed by crossbreeding HB9~(Cre+)mice with RhoA~(flox/flox)mice.We established two models for assaying dendrite degeneration and regeneration,in which the brachial plexus was transection or crush injured,respectively.We found that at 28 days after brachial plexus transection,the density,complexity,and structural integrity of dendrites in the ventral horn of the spinal cord of RhoA conditional knockout mice were slightly decreased compared with that in Cre mice.Dendrites underwent degeneration at 7 and 14 days after brachial plexus transection and recovered at 28–56 days.The density,complexity,and structural integrity of dendrites in the ventral horn of the spinal cord of RhoA conditional knockout mice recovered compared with results in Cre mice.These findings suggest that RhoA knockout in motor neurons attenuates dendrite degeneration and promotes dendrite regeneration after peripheral nerve injury. 展开更多
关键词 brachial plexus conditional knockout DEGENERATION DENDRITES motor neuron peripheral nerve injury REGENERATION RHOA spinal cord ventral horn
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利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰小鼠模型的技术优化进展
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作者 王煜 吴勇 +1 位作者 梁春南 范昌发 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2024年第5期152-158,共7页
CRISPR/Cas9技术的兴起,推动了生命科学各个领域的发展。随着对其认识的不断加深,人们进行了多重改进和优化,以适应不同的应用场景。在基因修饰小鼠模型制作中,CRISPR/Cas9技术的优化也带来了众多突破性进展。本文简要回顾了CRISPR/Cas... CRISPR/Cas9技术的兴起,推动了生命科学各个领域的发展。随着对其认识的不断加深,人们进行了多重改进和优化,以适应不同的应用场景。在基因修饰小鼠模型制作中,CRISPR/Cas9技术的优化也带来了众多突破性进展。本文简要回顾了CRISPR/Cas9技术的发展历程,并从CRISPR/Cas9元件优化、条件敲除/敲入基因修饰小鼠模型的构建以及CRISPR/Cas9元件和HDR模板的递送系统层面总结了优化策略,展望该技术未来的发展。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 小鼠模型 条件敲除/敲入 递送
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基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法的Ddx3x肝脏条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定
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作者 潘桢桢 徐玲 +5 位作者 张向颖 高耀 田原 范子豪 曹亚玲 任锋 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2024年第10期1275-1280,共6页
目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法... 目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法对F0代和F1代小鼠进行基因鉴定。将Ddx3x-flox F1代小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏条件性敲除Ddx3x基因小鼠(Ddx3x^(Δhep))。采用PCR方法和Western blotting方法分别检测Ddx3x^(Δhep)基因小鼠目的基因与蛋白的表达。选取8周龄雄性野生型C57/6J小鼠、Ddx3x^(Δhep)小鼠、Ddx3x^(fl/fl)小鼠,测定血清ALT、AST水平评价肝脏肝损伤情况。结果对F1代小鼠基因PCR鉴定的结果表明,基因型符合Ddx3x^(fl/fl);F1代小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代与Ddx3x^(fl/fl)小鼠杂交,即获得Ddx3x^(Δhep)小鼠;PCR与Western blotting结果显示,目的小鼠肝组织中Ddx3x基因和蛋白表达显著降低。此外,Ddx3x^(Δhep)小鼠无胚胎致死现象,出生后生理状况良好。正常饲养条件下,Ddx3x^(Δhep)小鼠与Ddx3x^(fl/fl)小鼠及野生型小鼠相比,血清ALT、AST指标及体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法成功构建了Ddx3x^(Δhep)小鼠动物模型,为后续研究Ddx3x在肝脏中的生物学功能及作用机制奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 Cre-LoxP系统 Ddx3x 肝脏条件性敲除小鼠
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阿尔茨海默病病变相关脑区Pgc-1alpha敲除小鼠模型的构建
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作者 史厚珍 张维君 +4 位作者 翟鸿儒 王贻界 王雨欣 刘子重 王佳 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2024年第5期423-427,450,共6页
目的:构建在阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)病变相关脑区过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1 alpha,Pgc-1alpha)敲除小鼠。方法:引入Pgc-1alpha条件性敲... 目的:构建在阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)病变相关脑区过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1 alpha,Pgc-1alpha)敲除小鼠。方法:引入Pgc-1alpha条件性敲除杂合子小鼠(Pgc-1alphafl/+),通过自交获得Pgc-1alpha条件性敲除纯合子小鼠(Pgc-1alphafl/fl)。将Pgc-1alphafl/fl纯合子小鼠和在AD病变脑区(皮层、海马)特异性表达Cre重组酶的Cre工具鼠(Calb1-Cre)杂交,提取子代转基因小鼠基因组DNA,行PCR鉴定,确定其基因型;采用蛋白免疫印迹技术检测转基因小鼠与野生型小鼠脑区及肾脏PGC-1α蛋白表达。结果:双重PCR鉴定结果显示,同时扩增出400 bp及444 bp条带的小鼠为AD病变脑区Pgc-1alpha敲除纯合子小鼠(Pgc-1alphafl/fl::Calb1-Cre,Pgc-1alpha-/-)。蛋白免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,条件性敲除小鼠脑区PGC-1α蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论:成功构建在AD病变相关脑区Pgc-1alpha敲除小鼠。 展开更多
关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(Pgc-1alpha) 条件性敲除 小鼠 阿尔茨海默病 皮层 海马
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结肠细胞Retnlb基因敲除小鼠的构建及初步表型分析
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作者 王飞英 周灵灵 +5 位作者 程贝贝 万佳婧 张超 易健 宋岚 戴爱国 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1788-1796,共9页
目的:基于CRISPR/Cas9技术构建Retnlb基因的floxp敲入小鼠Retnlbflox/+,进一步根据Cre-LoxP重组酶系统,构建肠道上皮Retnlb基因敲除小鼠(Retnlb-CKO),为后续探究Retnlb基因在炎性肠病中的发病机制提供动物模型。方法:选取8周龄基因型均... 目的:基于CRISPR/Cas9技术构建Retnlb基因的floxp敲入小鼠Retnlbflox/+,进一步根据Cre-LoxP重组酶系统,构建肠道上皮Retnlb基因敲除小鼠(Retnlb-CKO),为后续探究Retnlb基因在炎性肠病中的发病机制提供动物模型。方法:选取8周龄基因型均为Retnlbflox/+的雌、雄C57BL/6N小鼠合笼杂交,筛选出基因型为Retnlb^(flox/flox)的小鼠,将该基因型的小鼠与肠道上皮细胞特异性表达Cre重组酶(Vil1-Cre)工具鼠进行杂交繁育,筛选获得基因型为Retnlb^(flox/+,Cre+)小鼠;再将Retnlb^(flox/+,Cre+)小鼠与Retnlb^(flox/flox)小鼠杂交获得Retnlb^(flox/flox),Cre+目的小鼠(Retnlb-CKO)。选取8周龄Retnlb^(flox/flox),Cre+小鼠与同窝Retnlb^(flox/flox)小鼠各6只进行后续实验。采用RT-qPCR和免疫组化分别检测结肠上皮Retnlb mRNA和蛋白水平。观察每组小鼠的身长、体重、饮食和生殖能力等表型,计算其各组织重量与体重的比值以分析小鼠的生长发育情况。检测小鼠的肠道屏障完整性和结肠免疫炎症因子的表达情况。结果:通过基因鉴定、mRNA及蛋白水平证实肠道上皮细胞特异性条件敲除小鼠构建成功。与对照组小鼠相比,Retnlb-CKO小鼠的身长、体重、饮食和生殖能力均未发生明显的变化,心、肝、脾、肺、肾和结肠的重量与体重之比无差异,各组织无形态学差异。检测Retnlb-CKO小鼠结肠组织的紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin3的mRNA表达显著降低(P<0.01),PAS染色和免疫组化结果分别显示Retnlb-CKO小鼠结肠组织的杯状细胞数量和溶菌酶阳性细胞数量均显著减少(P<0.01)。HE染色观察Retnlb-CKO小鼠的结肠组织显示没有明显的炎症细胞浸润,RT-qPCR进一步显示结肠组织的促炎因子NLRP3、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达显著下调(P<0.01),同时,炎症信号通路蛋白TLR4、MyD88和NF-κB表达也显著下调(P<0.01)。结论:成功构建并验证了条件性结肠细胞Retnlb基因敲除小鼠模型。结肠细胞缺失Retnlb会导致肠道屏障受损,结肠组织促炎因子mRNA表达显著降低,炎症通路蛋白TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达显著下调。 展开更多
关键词 炎性肠病 Retnlb基因 Cre-LoxP系统 条件性敲除 促炎因子
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Liver-specific glucocorticoid action in alcoholic liver disease:Study of glucocorticoid receptor knockout and knockin mice
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作者 Yazheng Wang Conor Fahy Hong Lu 《Liver Research》 CSCD 2024年第2期91-104,共14页
Background and aim:Glucocorticoids are the only first-line drugs for severe alcoholic hepatitis(AH),with limited efficacy and various side effects on extrahepatic tissues.Liver-targeting glucocorticoid therapy may hav... Background and aim:Glucocorticoids are the only first-line drugs for severe alcoholic hepatitis(AH),with limited efficacy and various side effects on extrahepatic tissues.Liver-targeting glucocorticoid therapy may have multiple advantages over systemic glucocorticoid for AH.The aim of this study was to determine the role of hepatocellular glucocorticoid receptor(GR)in alcohol-associated steatosis(AS)and AH.Materials and methods:AS was induced by a high-fat diet plus binge alcohol in adult male and female mice with liver-specific knockout(LKO)and heterozygote of GR.AH was induced by chronic-plus-binge in middle-aged male mice with liver-specific knockin of GR.Changes in hepatic mRNA and protein expression were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction and Western blot.Results:GR-LKO aggravated steatosis and decreased hepatic expression and circulating levels of albumin in both genders of AS mice but only increased markers of liver injury in male AS mice.Marked steatosis in GR-LKO mice was associated with induction of lipogenic genes and down-regulation of bile acid synthetic genes.Hepatic protein levels of GR,hepatocyte nuclear factor 4 alpha,and phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 were gene-dosage-dependently decreased,whereas that of lipogenic ATP citrate lyase was increased in male GR heterozygote and LKO mice.Interestingly,hepatic expression of estrogen receptor alpha(ERα)was induced,and the essential estrogen-inactivating enzyme sulfotransferase 1e1 was gene-dosage-dependently down-regulated in GR heterozygote and knockout AS mice,which was associated with induction of ERα-target genes.Liver-specific knockin of GR protected against liver injury and steatohepatitis in middle-aged AH mice.Conclusions:Hepatic GR deficiency plays a crucial role in the pathogenesis of AS induced by high-fat diet plus binge,and liver-specific overexpression/activation of GR protects against chronic-plus-binge-induced AH in middle-aged mice.Hepatocellular GR is important for protection against AS and AH. 展开更多
关键词 Glucocorticoid receptor(GR) Alcohol-associated steatosis(AS) Alcoholic hepatitis(AH) HETEROZYGOTE Liver-specific knockout Liver-specific knockin Hepatic protection
原文传递
T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定
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作者 王卉卉 朱向玲 +5 位作者 吴旭铭 张慧茹 周园园 王安琪 刘崇 涂佳杰 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第4期595-599,共5页
目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因... 目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Western blot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠基因稳定遗传。与Spi1^(flox/flox)小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。 展开更多
关键词 Spi1 CRE/LOXP系统 CRISPR/Cas9技术 T细胞 PU.1 条件性敲除
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基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠
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作者 杨坤 章容 +4 位作者 吴越 雷小平 谌云川 康兰 董文斌 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2025年第14期2943-2950,共8页
背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP... 背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。 展开更多
关键词 SENP1 Cre-loxP重组酶系统 肺泡Ⅱ型上皮细胞 条件性基因敲除 小鼠
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蛋白激酶D3血管内皮细胞条件性敲除小鼠的构建及表型分析
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作者 张茜 马军虎 +4 位作者 海霞 马睿婷 宁晓茜 马小元 张淑雅 《宁夏医科大学学报》 2024年第9期873-877,885,共6页
目的构建Prkd3血管内皮细胞条件性敲除小鼠并分析其表型,探讨血管内皮细胞上Prkd3条件性敲除小鼠的敲除效率及可能的表型。方法利用Cre/LoxP系统构建血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠模型,即分别构建Prkd3flox/flox小鼠和Cdh5-Cre工具小... 目的构建Prkd3血管内皮细胞条件性敲除小鼠并分析其表型,探讨血管内皮细胞上Prkd3条件性敲除小鼠的敲除效率及可能的表型。方法利用Cre/LoxP系统构建血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠模型,即分别构建Prkd3flox/flox小鼠和Cdh5-Cre工具小鼠,再将两者进行交配,筛选得到Prkd3血管内皮条件性敲除小鼠(Cdh5-Cre;Prkd3flox/flox,简称Prkd3ΔEC)。在血管内皮细胞内特异性敲除Prkd3,通过鼠尾PCR法进行基因型鉴定;分离肝血窦内皮细胞并用Western blot检测敲除效率,通过功能学及组织病理学方法评估内皮细胞中Prkd3缺失对肝脏的影响。结果成功构建Prkd3ΔEC,敲除效率大于90%。表型分析发现,Prkd3ΔEC小鼠表现出自发性肝纤维化,随年龄增长逐渐加重(P<0.05);通过HE染色和天狼星红染色发现肝脏中胶原纤维增多,血管周围的纤维成分明显增多(P<0.05)。表明血管内皮细胞中Prkd3缺失能够诱发自发性肝纤维化。结论成功构建了Prkd3ΔEC,该条件性敲除小鼠的肝脏存在自发性肝纤维化情况。 展开更多
关键词 Prkd3 血管内皮细胞条件性敲除小鼠 CRE/LOXP系统 肝纤维化
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One-step generation of zebrafish carrying a conditional knockoutknockin visible switch via CRISPR/Cas9-mediated intron targeting 被引量:2
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作者 Jia Li Hong-Yu Li +3 位作者 Shan-Ye Gu Hua-Xing Zi Lai Jiang Jiu-Lin Du 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS CSCD 2020年第1期59-67,共9页
The zebrafish has become a popular vertebrate animal model in biomedical research.However,it is still challenging to make conditional gene knockout(CKO)models in zebrafish due to the low efficiency of homologous recom... The zebrafish has become a popular vertebrate animal model in biomedical research.However,it is still challenging to make conditional gene knockout(CKO)models in zebrafish due to the low efficiency of homologous recombination(HR).Here we report an efficient non-HR-based method for generating zebrafish carrying a CKO and knockin(KI)switch(zCKOIS)coupled with dual-color fluorescent reporters.Using this strategy,we generated hey2^zCKOIS which served as a hey2 KI reporter with EGFP expression.Upon Cre induction in targeted cells,the hey2^zCKOIS was switched to a non-functional CKO allele hey2^zCKOIS-inv associated with Tag RFP expression,enabling visualization of the CKO alleles.Thus,simplification of the design,and the visibility and combination of both CKO and KI alleles make our z CKOIS strategy an applicable CKO approach for zebrafish. 展开更多
关键词 NHEJ non-HR knockin conditional knockout visible switch zCKOIS ZEBRAFISH
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CRISPR/Cas9技术在昆虫基因功能研究中的应用及优化 被引量:2
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作者 刘露露 林哲 邹振 《热带生物学报》 2023年第1期50-59,共10页
主要概述了CRISPR/Cas9技术应用于涉及鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目、直翅目和双翅目的昆虫在色素沉着、抗性、嗅觉、交配和性别发生等方面的研究进展,包括基因敲除和基因敲入技术的应用,同时总结了目前CRISPR/Cas9系统的优化方案,... 主要概述了CRISPR/Cas9技术应用于涉及鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目、直翅目和双翅目的昆虫在色素沉着、抗性、嗅觉、交配和性别发生等方面的研究进展,包括基因敲除和基因敲入技术的应用,同时总结了目前CRISPR/Cas9系统的优化方案,最后对改良CRISPR/Cas9系统在昆虫基因组学研究和农业害虫防控的应用前景进行了展望。利用基因编辑技术对昆虫基因功能进行探究是除基因过表达、RNA干扰等方法外的一种有效策略。CRISPR/Cas9技术是近年来出现并迅速发展的第三代基因编辑工具,以操作简便、成本低和编辑效率高等优点而被广泛应用于生物科学中的各个分支。 展开更多
关键词 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 基因敲除 基因敲入
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条件性敲除D1133L基因的重组非洲猪瘟病毒的构建及增殖特性 被引量:1
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作者 张婷 冯涛 +9 位作者 杨金柯 郝雨 杨行 张大俊 史喜绢 闫文倩 陈玲玲 刘湘涛 郑海学 张克山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期706-714,共9页
前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130... 前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130,将重组转移载体转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs),以ASFV CN/GS/2018为亲本毒株感染BMDM,在β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的条件下,经绿色荧光和PCR鉴定,获得条件性敲除D1133L重组毒株vD1133Li。利用荧光显微镜观察该重组毒株与亲本毒株在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的复制差异,利用qPCR技术比较重组病毒与亲本毒株的复制差异,分析vD1133Li在无IPTG情况下回补D1133L蛋白后与在IPTG诱导情况下的复制差异。结果显示:本研究成功构建了条件性敲除D1133L的ASFV重组病毒vD1133Li,重组毒株不表达D1133L,在IPTG诱导下复制能力显著低于亲本毒株;在稳定表达D1133L的MA-104细胞系中,vD1133Li复制能力恢复。综上所述,D1133L基因对于ASFV复制至关重要,试验结果为进一步研究D1133L在ASFV致病中的机制及针对D1133L靶向药物研发提供了研究基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 条件性D1133L基因缺失 重组病毒 增殖特性
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利用Cre-loxP系统构建AT2细胞特异性敲除HDAC3基因小鼠 被引量:1
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作者 熊锐 李国瑞 +2 位作者 邹诗施 李宁 耿庆 《医学研究杂志》 2023年第2期24-29,148,共7页
目的应用Cre-loxP重组酶系统构建AT2细胞特异性敲除HDAC3基因小鼠HDAC3^(flox/flox)Sftpc-Cre(+/-)模型。方法首先将Sftpc-Cre(+/-)小鼠自交以获得更多的Sftpc-Cre(+/-)小鼠,将HDAC3^(flox/-)小鼠自交以获得HDAC3^(flox/flox)小鼠和HDAC... 目的应用Cre-loxP重组酶系统构建AT2细胞特异性敲除HDAC3基因小鼠HDAC3^(flox/flox)Sftpc-Cre(+/-)模型。方法首先将Sftpc-Cre(+/-)小鼠自交以获得更多的Sftpc-Cre(+/-)小鼠,将HDAC3^(flox/-)小鼠自交以获得HDAC3^(flox/flox)小鼠和HDAC3^(flox/-)小鼠;然后,将Sftpc-Cre(+/-)小鼠与HDAC3^(flox/flox)小鼠或HDAC3^(flox/-)小鼠杂交,得到双杂合HDAC3^(flox/-)Sftpc-Cre(+/-)小鼠;最后将HDAC3^(flox/-)Sftpc-Cre(+/-)小鼠与HDAC3^(flox/flox)小鼠或HDAC3^(flox/-)小鼠杂交,获得目的小鼠HDAC3^(flox/flox)Sftpc-Cre(+/-);对产生的子代剪取鼠尾提取基因组DNA,选取相对应的引物对目的基因进行扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳实验以鉴定基因型。选取6~8周龄的目的小鼠及对照组小鼠(HDAC3^(flox/flox))各3只,取肺组织进行免疫荧光双标实验以验证HDAC3敲除效果,取心脏、肝脏、肺、肾脏组织进行HE染色以观察两种小鼠各脏器的组织形态。结果琼脂糖凝胶电泳实验正确鉴定出了子代小鼠,筛选出了目的小鼠HDAC3^(flox/flox)Sftpc-Cre(+/-)。HDAC3在小鼠肺AT2细胞中被成功敲除。两种小鼠的心脏、肝脏、肺和肾脏组织形态无明显改变。结论本研究利用Cre-loxP技术成功构建了AT2细胞特异性敲除HDAC3基因小鼠,为后续进一步研究HDAC3基因在肺部疾病发生、发展中的作用提供了优良的工具。 展开更多
关键词 HDAC3 AT2细胞 条件性基因敲除小鼠
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巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠的构建及鉴定 被引量:1
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作者 黄庆 甄兰 +3 位作者 赵桂霖 赵汝舟 叶新萍 吴飞翔 《中国癌症防治杂志》 CAS 2023年第6期630-636,共7页
目的构建并鉴定巨噬细胞条件性高尔基体蛋白73(golgi protein 73,GP73)基因敲除小鼠,为进一步研究GP73调控巨噬细胞功能影响肿瘤性疾病的发生发展提供动物模型。方法基于Cre/LoxP重组系统构建GP73^(flox/+)小鼠,通过GP73^(flox/+)小鼠... 目的构建并鉴定巨噬细胞条件性高尔基体蛋白73(golgi protein 73,GP73)基因敲除小鼠,为进一步研究GP73调控巨噬细胞功能影响肿瘤性疾病的发生发展提供动物模型。方法基于Cre/LoxP重组系统构建GP73^(flox/+)小鼠,通过GP73^(flox/+)小鼠雌雄自交得到GP73flox/flox小鼠。将GP73flox/flox小鼠与Lyz2⁃Cre+小鼠杂交,得到GP73flox/+Lyz2⁃Cre+小鼠,再将其与GP73flox/flox小鼠杂交,最终得到基因型为GP73flox/floxLyz2⁃Cre+的巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠(MKO小鼠);以GP73flox/floxLyz2⁃Cre-小鼠作为对照组小鼠(GP73^(fl/fl)小鼠)。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠flox及Cre基因型。采用实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)分别从mRNA水平和蛋白水平验证小鼠巨噬细胞GP73敲除效果及组织特异性。计算小鼠各组织质量与体重的比值以分析小鼠的生长发育情况,并检测小鼠血生化指标。结果通过基因鉴定、mRNA水平及蛋白水平证实巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠构建成功。qPCR检测显示,与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow⁃derived macrophages,BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(peritoneal macrophages,PM)中GP73 mRNA水平均降低(P<0.0001);Western blot检测结果显示,GP73蛋白在MKO小鼠BMDMs和PM中的表达水平均较GP73^(fl/fl)小鼠明显降低,但在肝脏、肾脏及胸腺组织中GP73蛋白表达水平无显著差异。与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠心、肝、脾、肺、肾、棕色脂肪及白色脂肪组织重量与体重之比无差异,各组织无形态学差异。血生化检测结果显示,MKO小鼠与GP73^(fl/fl)小鼠的各项血生化指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠模型,为深入研究GP73调控巨噬细胞功能在肿瘤性疾病中的作用和机制提供良好的动物模型。 展开更多
关键词 高尔基体蛋白73 巨噬细胞 CRE/LOXP重组系统 条件性敲除 基因型鉴定 小鼠模型
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Selective deletion of zinc transporter 3 in amacrine cells promotes retinal ganglion cell survival and optic nerve regeneration after injury 被引量:2
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作者 Zhe Liu Jingfei Xue +10 位作者 Canying Liu Jiahui Tang Siting Wu Jicheng Lin Jiaxu Han Qi Zhang Caiqing Wu Haishun Huang Ling Zhao Yehong Zhuo Yiqing Li 《Neural Regeneration Research》 SCIE CAS CSCD 2023年第12期2773-2780,共8页
Vision depends on accurate signal conduction from the retina to the brain through the optic nerve,an important part of the central nervous system that consists of bundles of axons originating from retinal ganglion cel... Vision depends on accurate signal conduction from the retina to the brain through the optic nerve,an important part of the central nervous system that consists of bundles of axons originating from retinal ganglion cells.The mammalian optic nerve,an important part of the central nervous system,cannot regenerate once it is injured,leading to permanent vision loss.To date,there is no clinical treatment that can regenerate the optic nerve and restore vision.Our previous study found that the mobile zinc(Zn^(2+))level increased rapidly after optic nerve injury in the retina,specifically in the vesicles of the inner plexiform layer.Furthermore,chelating Zn^(2+)significantly promoted axonal regeneration with a long-term effect.In this study,we conditionally knocked out zinc transporter 3(ZnT3)in amacrine cells or retinal ganglion cells to construct two transgenic mouse lines(VGAT^(Cre)ZnT3^(fl/fl)and VGLUT2^(Cre)ZnT3^(fl/fl),respectively).We obtained direct evidence that the rapidly increased mobile Zn^(2+)in response to injury was from amacrine cells.We also found that selective deletion of ZnT3 in amacrine cells promoted retinal ganglion cell survival and axonal regeneration after optic nerve crush injury,improved retinal ganglion cell function,and promoted vision recovery.Sequencing analysis of reginal ganglion cells revealed that inhibiting the release of presynaptic Zn^(2+)affected the transcription of key genes related to the survival of retinal ganglion cells in postsynaptic neurons,regulated the synaptic connection between amacrine cells and retinal ganglion cells,and affected the fate of retinal ganglion cells.These results suggest that amacrine cells release Zn^(2+)to trigger transcriptomic changes related to neuronal growth and survival in reginal ganglion cells,thereby influencing the synaptic plasticity of retinal networks.These results make the theory of zinc-dependent retinal ganglion cell death more accurate and complete and provide new insights into the complex interactions between retinal cell networks. 展开更多
关键词 axonal regeneration conditional knockout NEUROTRANSMITTER optic nerve injury presynaptic neuron retinal network synaptic connection synaptic vesicles visual acuity zinc transporter 3
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条件敲除Sdr9c 7基因小鼠的构建及表型研究
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作者 周晶 李银玲 +1 位作者 陈俏媛 林万华 《广西师范大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第2期147-153,共7页
利用在Sdr9c7基因第2外显子两侧的内含子区域重组添加有loxP位点的小鼠与上皮细胞特异性表达Cre重组酶的K14Cre小鼠交配产生的子代再进行杂交,获得基因型为Sdr9c7^(fl/fl)K14Cre^(+)的小鼠(上皮细胞Sdr9c7基因特异性敲除小鼠)。在体式... 利用在Sdr9c7基因第2外显子两侧的内含子区域重组添加有loxP位点的小鼠与上皮细胞特异性表达Cre重组酶的K14Cre小鼠交配产生的子代再进行杂交,获得基因型为Sdr9c7^(fl/fl)K14Cre^(+)的小鼠(上皮细胞Sdr9c7基因特异性敲除小鼠)。在体式镜下观察小鼠表型,用显微镜观察皮肤组织HE染色石蜡切片,拍照观察小鼠皮肤的组织形态结构,利用甲苯胺蓝渗透法检测小鼠皮肤的屏障功能。结果发现:Sdr9c7^(fl/fl)K14Cre^(+)小鼠皮肤发绀,在出生后6~8 h内死亡;HE染色结果表明Sdr9c7^(fl/fl)K14Cre^(+)基因型小鼠的皮肤角质层结构异常,堆积紧密。甲苯胺蓝染液渗透实验中Sdr9c7^(fl/fl)K14Cre^(+)基因型小鼠的皮肤可被染液透过而染成深色,表明其表皮屏障功能不全。 展开更多
关键词 Sdr9c7基因 上皮细胞 条件敲除小鼠 皮肤屏障
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bdhA基因敲除及发酵条件优化提高枯草芽孢杆菌四甲基吡嗪含量研究 被引量:1
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作者 王丽丰 李雯 谢和 《食品与发酵科技》 CAS 2023年第1期8-14,共7页
四甲基吡嗪是白酒重要风味物质的组成成分,赋予白酒一定的健康功效。为提高菌株发酵产四甲基吡嗪的含量,本研究以枯草芽孢杆菌E20为原始菌株,利用同源重组敲除其2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因(bdhA),成功构建突变菌株E20-ΔbdhA。将... 四甲基吡嗪是白酒重要风味物质的组成成分,赋予白酒一定的健康功效。为提高菌株发酵产四甲基吡嗪的含量,本研究以枯草芽孢杆菌E20为原始菌株,利用同源重组敲除其2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因(bdhA),成功构建突变菌株E20-ΔbdhA。将突变菌株和原始菌株接种到黄豆发酵培养基模拟产酱香固态发酵。结果表明,突变菌株发酵物中四甲基吡嗪的含量为100.45 mg/kg,比原始菌株提高了71.97%,酱香风味无明显变化。利用突变菌株E20-ΔbdhA对其固态状态下合成四甲基吡嗪的条件进行优化,确定当种子菌液接种量为5%,发酵培养基为高粱小麦(1∶1),(NH4)2HPO4的添加量为70 g/kg时,发酵物中四甲基吡嗪的含量最高为380.61 mg/kg。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 四甲基吡嗪 基因敲除 发酵条件优化 酱香风味
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CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系
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作者 甘暨 杨丽超 +3 位作者 张起 孙俊铭 张俊 何敏 《广西医科大学学报》 CAS 2023年第2期173-181,共9页
目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同... 目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果:成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;pALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞,为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。 展开更多
关键词 VASN CRISPR/Cas9 Cre-Loxp系统 条件性敲除 AML12细胞
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巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠的构建及功能分析
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作者 秦琪 李娟 +2 位作者 杨柳 方亮 陈丽华 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期428-436,共9页
目的构建并鉴定巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,为研究CD226分子调节巨噬细胞表型和功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法通过Cd226^(flox/+)雌雄小鼠自交,得到基因型Cd226^(flox/flox)小鼠。Cd226^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠... 目的构建并鉴定巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,为研究CD226分子调节巨噬细胞表型和功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法通过Cd226^(flox/+)雌雄小鼠自交,得到基因型Cd226^(flox/flox)小鼠。Cd226^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠杂交,获得Cd226^(flox/+)Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Cd226^(flox/flox)小鼠杂交,最终获得Cd226^(flox/flox)Lyz2-Cre^(+)小鼠,即巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型;采用流式细胞术、qRT-PCR和Western Blot验证小鼠巨噬细胞CD226敲除效果;采用Transwell实验检测CD226对小鼠巨噬细胞迁移能力的影响。结果从基因和蛋白水平证实巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠构建成功。Transwell实验结果显示,与对照组相比,巨噬细胞条件性敲除CD226分子显著抑制腹腔巨噬细胞的迁移。结论成功构建巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,为后续深入研究CD226调控巨噬细胞功能在免疫性疾病发病中的作用和机制提供更加精准的实验动物模型。 展开更多
关键词 CD226 条件性敲除 基因型鉴定 巨噬细胞 迁移
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