基于微流体芯片用于单个DNA分子检测的共焦激光诱发荧光系统（英文）

微流体分析中常用的荧光检测是一种模拟方式的测量,并且通常情况下测量信号的强度会随着分析物采样量的减少而减弱。本文构建了一种共焦光学系统的激光诱发荧光单分子检测仪器,可以进行单个脱氧核糖核酸分子的数字化测量,采用这种仪器检测可不依赖于样品的多少;对诱发激光的功率大小进行了优化,当诱发激光的功率为1 mW时信噪比最高,可达30;对用于制造微流体芯片的几种不同高分子基片材料也做了检验和比较,其中环烯烃共聚物具有极低的自发荧光背景,这对光子簇的识别非常有利,实验结果表明环烯烃共聚物是制造单分子检测微流体芯片的首选材料;这种单分子检测仪器能够对流经微流体通道的单个脱氧核糖核酸分子进行数字式甄别,其动态检测范围上至25 pmol/L,下至单个分子水平。本研究中对单分子检测实验所涉及的一些方面进行了考虑,这为单分子测量在更大范围内生物分析上更多的实际应用提供了依据。

SIGIRR-EGFP真核表达载体构建及在H292细胞中的亚细胞定位研究

目的通过增强型绿色荧光蛋白示踪技术,观察SIGIRR(single Ig IL-1R-related molecule)在人气道上皮细胞株H292中的分布特点及对上皮细胞天然免疫功能的影响。方法构建SIGIRR-EGFP融和蛋白的真核表达载体,运用脂质体转染的方法转染人气道上皮细胞株H292,再利用激光共聚焦显微镜对其进行亚细胞定位研究。经LPS刺激后,ELISA检测转染前后上皮细胞TNF-α分泌水平的差异。结果构建的融和蛋白表达载体SIGIRR-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后,电泳显示其条带大小为4.7 kb和1.23 kb左右,经测序证实SIGIRR的序列与GenBank公布的人cDNA序列完全一致。激光共聚焦显示pEGFP-N1空载体转染表达的绿色荧光蛋白在H292细胞中均匀分布,而重组载体SIGIRR-EGFP表达的融和蛋白在H292细胞核周(膜)和细胞膜边缘上有连续分布现象。经LPS刺激后,pEGFP-N1转染的细胞和未转染细胞TNF-α水平无显著性差异(P>0.05),而SIGIRR-EGFP转染细胞与pEGFP-N1转染细胞相比,显著降低了TNF-α的产生(P<0.01)。结论成功构建了SI-GIRR-EGFP融和蛋白的真核表达载体,并利用绿色荧光蛋白标记的方法显示了SIGIRR分子在H292细胞中细胞膜分布。过表达的SIGIRR降低了上皮细胞LPS诱导的炎症因子TNF-α产生。

单分子荧光涨落系统的研制

报道一种单分子荧光涨落检测系统的实验装置的设计。该系统主要由激光共焦系统、微区激发系统、光电转换及数据采集和分析系统组成。本文另对共焦系统和数据采集系统的原理作了简要的说明。由于采用了共焦系统 ,这样就可以从一个视场深度比较窄的区域内采集生物信息 ,而不需要象普通荧光采集系统那样大范围采集 ,焦点外的荧光可以直接消除 ,结果对比度、清晰度、灵敏度都增加了。加上先进的数据采集及处理系统 ,因而可实现在分子水平上对荧光信号进行检测 。