RPA检测技术在禽源病原检测中的研究进展

重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification, RPA)是一种近年来研究者关注较多的新型恒温核酸扩增技术,该方法操作便捷、扩增速度快、特异性强及灵敏度高,无需借助精密仪器,且在恒温环境下(25~45℃)即可完成核酸检测,极有可能取代传统PCR检测技术。RPA检测技术迄今发展十余年,已广泛应用于细菌、病毒、真菌、寄生虫及耐药基因检测等领域,被认为是当前最有潜力的快速分子诊断工具,具有较为广泛的应用前景。笔者就RPA检测、技术优势、常见检测方式及其在禽源病原检测方面的研究进展进行概述,旨在为临床禽源病原新型检测技术的研究提供一定理论参考。

多温区恒等温快速核酸检测仪温度校准方法研究

恒等温扩增技术无需反复升降温和循环,能提高核酸扩增和检测的速度,被广泛应用于核酸POCT设备中。本文针对多温区恒等温快速核酸检测仪的结构、控温原理及关键点,对多温区快速核酸检测仪的温度偏差、升温速率、温度波动度和温度持续时间偏差进行校准和分析,并验证了该校准方法的可行性和合理性。

猪口腔液中伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸稳定性研究

猪口腔液作为一种生物检材,在猪群疫病监测和诊断中受到越来越广泛的应用。目前尚不清楚病毒核酸在口腔液中的稳定性。利用猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒,采用荧光定量PCR技术,评估核酸保护剂和保存温度对病毒核酸在口腔液中稳定性的影响。结果显示,在4℃或室温条件保存1 d后,核酸保护剂组病毒核酸含量比对照组分别高10倍或100倍左右,二者差异显著(P<0.05或P<0.01);当使用核酸保护剂时,在4℃或室温条件保存1 d~3 d,病毒核酸含量依然保持稳定,二者差异不显著;而当不使用核酸保护剂,保存1 d后,4℃条件下病毒核酸含量比室温条件下高10倍左右。使用不同公司的核酸提取产品提取含有核酸保护剂的样品,在核酸提取效率上无显著差异,说明核酸保护剂对后续核酸提取产品具有很好的兼容性。表明核酸保护剂和低温在防止口腔液中病毒核酸降解方面效果显著,研究结果为临床猪口腔液作为生物检材的科学使用提供了参考。

迪澳结核分枝杆菌恒温核酸检测法、Xpert MTB/RIF检测法与传统固体罗氏培养法的比较

目的比较不同检测方法在结核分枝杆菌检测中的应用及价值。方法选取2018年6月至2019年5月间在惠州市结核病防治研究所结核科就诊的400份结核病患者的标本进行研究,分别采用迪澳恒温核酸检测、Xpert检测、固体培养以及痰涂片四种方法进行检测,并分析四种检测方法的阳性率。结果迪澳恒温核酸检测法、Xpert检测法、固体培养检测法、痰涂片检测法的阳性率分为78.00%(312/400)、76.25%(305/400)、63.50%(254/400)和62.00%(248/400)。迪澳恒温核酸检测法和Xpert检测法均高于固体培养和痰涂片检测法,差异有统计学意义(P<0.05)。迪澳恒温核酸和Xpert检测法均敏感度和特异度高于固体培养和痰涂片检测法,但差异无统计学意义(P>0.05)。对四种方法进行Kappa检验,检测结果一致性均比较高,K值分别为0.523,0.769,0.627和0.546。结论结核分枝杆菌常见的检测方法中,迪澳恒温核酸和Xpert检测的阳性率、敏感度和特异度要高于固体培养和及痰涂片检测,但四种检测方法的检测结果一致性和约登指数均比较高,若联合使用效果可能更佳。

重组酶聚合酶扩增技术在动物疫病诊断中的应用研究进展

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种基于T4噬菌体复制机理为主要反应机理的核酸恒温扩增技术,广泛应用于动物疫病诊断、动物食品安全和遗传分析等领域。反应可在25~42℃温度条件下20 min完成快速扩增,具有条件温和、灵敏度高、特异性好、无需昂贵试验仪器和简便快捷等优点,适用于现场快速检测,已被应用于常见动物疫病的诊断。为让更多技术人员了解RPA技术诊断的优势,论文对RPA技术原理、引物探针设计、检测方法及在动物疫病诊断中的应用进行了分析。

恒温荧光核酸检测仪检测2种食源性致病菌的方法验证

目的以传统国标培养法作为参考比对方法,考察恒温荧光核酸检测仪(constant temperature fluorescent nucleic acid detector)检测食品(自然食品和加标食品)中食源性致病菌如阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的一致性。方法通过对食品中阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌国标培养法和恒温荧光核酸检测仪方法检测结果的比对,考量后者方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率和准确度。结果恒温荧光核酸检测仪检测食品中阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度和特异性都是100%,假阴性率为0;假阳性率为0。结论恒温荧光核酸检测仪方法特异性强、准确度高、无一例漏检。

实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用分析

目的采用统计学方法评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在临床淋球菌检测中的应用。方法以淋球菌培养法为标准对照,采用实时荧光核酸恒温扩增技术同时对150例疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测,对结果进行统计学分析比较,并用PCR法进行验证。结果使用SAT检测的生殖道拭子和尿液阳性检出均为110例,培养法阳性检出为108例,其中培养法检出阴性的2例通过PCR验证为阳性。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义(P>0.05);以培养法为金标准,SAT检测拭子的敏感度为100.0%,特异度为95.2%;SAT检测尿液标本的敏感度为100.0%,特异度为95.2%。结论采用实时荧光核酸恒温扩增技术对生殖道拭子和尿道标本的检测效果与培养法相比,阳性率高,敏感度较高,且尿道标本收集方法比较简便,患者依从性好,可代替拭子道取样方法,此方法可在临床推广应用。

快速核酸检测仪温度校准装置研制

新冠病毒的全球蔓延,催生快速核酸检测仪的发展,从而提出快速核酸检测仪的计量校准需求。温度控制在快速核酸检测仪的基因扩增过程中起着关键作用,由于其升降温速度快,比常规的PCR仪对温度的控制要求更高,从而对其温度参数的计量校准提出新的要求。该文通过对目前市上使用较多的两种试剂孔结构的快速核酸检测仪模型仿真,采用高精度温度传感器,通过低功耗高速数模转换设计、模块对接与协同集成、数据存储与保护设计、供电系统与能耗分配优化、无线传输模块设计与接口调试,成功研制锥形孔型和扁平孔型无线温度采集器,能独立完成温度数据采集、ADC转换和无线传输的功能。通过PC专用校准软件开发实现对实时荧光PCR快速核酸检测仪温度参数的校准。校准装置经计量检测和试验验证,温度测量最大允许误差为±0.1℃,最高采集频率为10Hz,满足快速核酸检测仪校准的要求。

比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法在解脲脲原体(UU)检测中的诊断价值

目的:研究在解脲脲原体(UU)检测中实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法的诊断价值。方法:收集141例2018年6月~2019年6月间前来某院就诊的疑似解脲脲原体感染的患者为研究对象,所有患者均采集2份拭子样本,其中1份拭子样本进行SAT检测,1分拭子样本进行液体培养,比较两种检测结果。结果:SAT法检测阳性率低于液体培养法(P<0.05);SAT法检测灵敏度高于液体培养法(P<0.05),特异度高于液体培养法(P<0.05)。结论:解脲脲原体(UU)检测中SAT法比液体培养法灵敏度和特异度高,而且低污染、时间短、样本采集方便、反应稳定,检测结果更加准确。

恒温扩增核酸仪校准方法

介绍了恒温扩增核酸分析仪的工作原理。根据仪器的性能提出了该仪器的校准项目和技术指标:温度示值误差、温度均匀度、温度波动度、样本检测重复性、荧光强度或浊度检测重复性和荧光强度或浊度线性;重点探讨了仪器计量指标的校准方法,形成了一套系统的恒温扩增核酸分析仪校准方法,并对恒温扩增核酸分析仪进行了实际校准。结果表明,该方法科学合理、简便易行,可操作性强,可用于评价仪器计量性能,为仪器日常的校准工作以及国家计量校准规范的制定奠定了基础。

实时荧光核酸恒温扩增技术和尿液快速检测法对孕前优生健康检查人群中淋球菌检测的应用比较

目的:比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和尿液快速检测法在淋球菌检测中的诊断价值,以选择更为准确、快速、实用的临床检测方法。方法:采集某站孕前优生健康检查人群200例,每例分别进行快速法和SAT法检测,每例另取1份分泌物拭子标本做分离培养金标准对照用。结果:快速法阳性率为28%,SAT法阳性率为22%,其中疑似标本快速法与SAT法阳性率分别为44%、39%,无症状标本快速法与SAT阳性率分别为12%、5%。尿液快速法的敏感性和特异性分别为100%、90%,SAT法的敏感性和特异性分别为100%、97.5%。结论:尿液快速法与SAT法的敏感性均较好,SAT法的特异性高于尿液快速法。尿液快速法简单、灵敏,可作为基层单位大批量体检标本的初筛方法,SAT技术精准、特异,针对可疑标本配合使用可以帮助临床综合诊断,提高淋球菌检测的准确率。

多联孔快速核酸检测仪温度校准装置研制

本文针对小通量快速核酸检测仪校准需求及结构特点,设计研制了一种多联孔快速核酸检测仪温度校准装置,能准确可靠地对8通量、16通量及以8通量为单元叠加的各类快速核酸检测仪进行温度校准。同时,在温度校准装置基础上,设计开发了自动校准软件,实现了校准任务流程化、自动化设计及历史校准任务管理,可更加高效地开展校准工作。

实时荧光核酸恒温扩增技术检测无创样本沙眼衣原体的性能

目的评估实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)检测无创样本沙眼衣原体的性能。方法以罗氏Cobas®4800CT/NG作为参照试剂,收集广西壮族自治区皮肤病研究所性病门诊就诊的男性患者尿液样本(248份)及女性患者阴道拭子样本(224份),评估SAT法检测沙眼衣原体的临床性能。结果最终有470份样本纳入统计。罗氏PCR检出阳性60例(12.8%),男性阳性数33例,女性27例;SAT检出沙眼衣原体阳性41例(8.7%),男性阳性数19例,女性22例。SAT试剂应用男性尿液检测的灵敏度为57.58%,特异性为99.06%;女性阴道拭子检测的灵敏度为81.48%,特异性100.00%。结论SAT试剂可以应用于无创样本,但是其应用尿液检测沙眼衣原体上还需要对尿液的核酸提取方法进一步的优化,提高其检测的灵敏性。

交叉引物恒温扩增技术结合核酸试纸条检测沙门菌方法的建立

目的 建立一种快速检测沙门菌的交叉引物恒温扩增技术(CPA)-核酸试纸条法。方法 收集不同来源的15株沙门菌和非沙门菌,作为实验用菌株,使用加热煮沸法提取细菌DNA核酸;对CPA方法进行敏感性和特异性研究,并与沙门菌荧光定量PCR法进行比较与评价。结果 特异性试验结果显示,本研究建立的CPA-核酸试纸条法对15种沙门菌的检测阳性率达100%,对15株非沙门菌检测结果全部为阴性。灵敏性试验结果显示,对沙门菌的纯菌液灵敏度检测极限为1.6 cfu/ml,模拟样本的检测限达到160 cfu/g,与荧光定量PCR法一致。结论 该方法检测沙门菌具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于沙门菌快速检测。

不同方法检测女性生殖道病原微生物感染的临床价值

目的分析不同方法检测女性生殖道病原微生物感染的临床价值。方法选取我院2019年12月-2020年12月共200例疑似生殖道病原微生物感染女性作为研究组,另选取200例正常女性体检者作为对照组,以固体培养法为标准,分析核酸恒温扩增检测技术(SAT)与液体培养法或乳胶法检测生殖道病原微生物感染情况及其临床价值。结果研究组检出阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。SAT法检测UU阳性率与培养法比较,差异无统计学意义(P>0.05),且以培养法为参考标准,SAT敏感度为94.00%,特异度为84.00%。乳胶法检测CT阳性率与SAT法比较,差异无统计学意义(P>0.05),且以乳胶法为参考标准,SAT敏感度为100.00%,特异度为96.15%。结论女性生殖道病原微生物感染中以UU最为常见,其次分别为CT、MG。目前临床中常用的SAT法、液体培养法、乳胶法在检测方面均有一定的应用价值,其中SAT法对病原微生物感染的检出率更高,可作为临床首选的检测方案之一。

SAT在肺炎支原体肺炎诊断中应用价值分析

目的难治性肺炎支原体肺炎及重症肺炎病情重,并发症多,严重影响患儿健康及日后生活,需尽早明确诊断及治疗。本研究采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing,SAT)对社区获得性肺炎患儿咽拭子及肺炎支原体肺炎患儿肺泡灌洗液标本进行检测,评估其在儿童肺炎支原体肺炎中应用价值。方法选取2017-09-01-2018-12-31郑州大学附属儿童医院住院的社区获得性肺炎患儿300例,并采用颗粒凝集法检测肺炎支原体血清抗体(pneumonia mycoplasma serum antibody,MP-Ab)、SAT检测肺炎支原体RNA;评估SAT在肺炎支原体肺炎临床诊断中的实用价值。结果SAT检测阳性共128例,其中肺炎支原体肺炎患儿120例,非肺炎支原体肺炎患儿8例;单份肺炎支原体血清抗体阳性125例,其中肺炎支原体肺炎91例,非肺炎支原体肺炎34例。SAT用于诊断肺炎支原体肺炎的真实性(约登指数=0.83)高于单份肺炎支原体血清抗体(约登指数=0.46);SAT用于诊断肺炎支原体肺炎时,与临床的一致性(Kappa值=0.84,P<0.001)高于单份肺炎支原体血清抗体(Kappa值=0.47,P<0.001)。56例肺炎支原体肺炎患儿进行肺泡灌洗检测,灌洗液阳性53例,咽拭子阳性51例,两种标本阳性检出率差异无统计学意义,χ2=2.322,P=0.128。结论SAT在肺炎支原体肺炎的诊断中应用价值高;SAT在不同类型标本中的肺炎支原体检出一致性好。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术、胶体金法、酶联免疫法在检测儿童肺炎支原体感染中的应用比较

目的比较实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)、胶体金法、酶联免疫法3种不同检测方法在儿童肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,Mp)感染中的应用。方法用实时荧光核酸恒温扩增检测技术、胶体金法和酶联免疫法3种检测方法检测300例肺炎患儿发病期及痊愈期的Mp感染状况,并进行相关统计分析。结果实时荧光核酸恒温扩增检测技术、胶体金法和酶联免疫法3种检测方法发病期阳性率分别为29.9%、16.63%、20.07%,3者比较差异有统计学意义(P<0.05)。痊愈期实时荧光核酸恒温扩增检测技术、胶体金法及酶联免疫法阳性率分别为1.9%、26.3%、21.9%,3者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SAT-MP是感染初期发现肺炎支原体的有效和有价值的诊断工具。胶体金法和酶联免疫法在支原体肺炎痊愈期检测阳性率较高,各种方法之间是一种互相补充的关系。

实时荧光核酸恒温扩增结合血清生化指标在肺结核诊断中的应用价值

目的探讨实时荧光核酸恒温扩增检测(SAT)结合血清性激素结合蛋白(SHBG)、血清淀粉样蛋白4(SAA4)、NK细胞检测在诊断肺结核中的价值。方法选择2018年4月—2020年1月间的肺结核患者72例作为肺结核组,同期治疗的非肺结核患者57例为对照组。肺结核均经结核分枝杆菌培养确诊,测定SAT,用酶联免疫吸附试验检测SHBG、SAA4,用FASCalibur流式细胞仪测外周血NK细胞;根据ROC曲线分析不同指标诊断效能。结果 72例肺结核患者中有70例经SAT诊断,与临床诊断符合率为97.22%;肺结核组SHBG、SAA4水平分别为(153.98±32.57)mmol/L、(98.23±6.81)ng/mL,均高于对照组[(61.36±4.34)mmol/L、(42.98±4.16)ng/mL](P <0.05);NK细胞水平(11.51±2.14)%低于对照组(16.79±3.12)%(P <0.05);ROC曲线结果表明,SAT联合SHBG、SAA4及NK细胞在肺结核诊断中的灵敏度高于单一SAT、SHBG、SAA4及NK细胞检测(P <0.05);特异度低于单一检测(P <0.05)。结论血清SAT、SHBG、SAA4及NK细胞在肺结核患者中表达异常,联合检测能获得较高的诊断效能。

不同抗结核时长对手术标本中不同病原学阳性率影响

目的探讨不同抗结核时长的手术病理标本5种病原学检测技术阳性率差异及临床意义。方法对2017年在武汉市肺科医院外科经规范抗结核共282例肺外结核患者按手术取材前抗结核时间不同分为0~<7 d、7~<14 d、14~<28 d、28~<60 d和≥60 d共5组,对各组采用抗酸染色涂片(AFB)、实时荧光定量PCR(TB-DNA)、RNA恒温扩增实时荧光检测(SAT-TB)、GeneX-pert MTB/RIF(X-pert)、结核培养(CTB)等5种方法进行病原学检查,并对结果进行分析。结果以临床诊断为标准,282例手术标本病原学总阳性率为89.36%(252/282),X-pert、TB-DNA、SAT-TB、CTB和AFB阳性率分别为89.36%、78.01%、39.72%、15.25%和14.18%;以CTB为金标准,SAT-TB的阴性预测值为92.35%(157/170);X-pert与CTB判定RFP耐药吻合率为100.00%。组间相同检查比较:CTB在0~<28 d内阳性率无明显差异,但均显著高于≥60 d患者(P<0.001),其余4种方法各时间段内比较均无明显差异。组内不同检查间比较:X-pert阳性率在各组内均显著高于AFB、SAT-TB、CTB(P<0.001),但与TB-DNA比较无统计学差异;TB-DNA各组内均显著高于AFB、CTB、SAT-TB(P<0.05);各组内CTB与AFB均无统计学差异(P>0.05);28 d后CTB阳性率均明显低于SAT-TB(P<0.001)。结论不同抗结核时长的手术病理组织标本中5种病原学检测技术阳性率差异较大,规范抗结核0~28 d内常规送检X-pert、CTB有利于结核病的诊断和治疗,X-pert、TB-DNA、SAT-TB、AFB阳性均不宜作为疗效评估的单一指标,而SAT-TB可作为CTB阴性的预测指标。