用改装的Super-Spinner搅拌瓶连续灌流培养产凝血酶原CHO工程细胞

A Super\|Spinner was Modified by mounting a stainless steel filter(pore size 75 μm)to the impeller shaft to retain cells while fresh nutrient is perfused.Using Macroporous microcarrier Cytopore 1,continuously perfused cultivation of a recombinant CHO cell line,CHO2DS producing prothrombin was performed with the perfusion of a protein\|free medium DF6S.The cell retention rate was more than 90% during the 24 days continuously perfused cultivation.The viable cell density of CHO2DS and prothrombin concentration reached 4.62×10 6(cells.m/L) and 11.3(mg/L)respectively after 9 days culture.

30L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂

目的应用30L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)。方法将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30L生物反应器中,并采用BiocommandPlus软件系统实时监控。先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养。在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性。采用Lysine-Sepharose4B和Zn2+-Sepharose4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度。结果整个培养过程持续51d,包括生长培养6d,表达培养45d,平均日灌流量为46.7L,最高达60L,共收获表达培养液约2100L;rht-PA的平均表达水平为15.15mg/L,最高可达19.25mg/L,生物学活性平均约为8000IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达最高水平(15.97g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×105IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上。结论应用30L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达。

超声截留灌流培养重组CHO细胞工艺优化

目的采用超声截留控制器超声使得细胞聚集、沉降的方法截留悬浮细胞,优化重组CHO细胞灌流培养工艺。方法基于无血清化学限定(CD)培养基,选择表达水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(VZV gE)的重组CHO细胞在5 L生物反应器中灌流培养。对初步确定的培养条件进行响应面分析,优化培养温度、培养基pH、灌流速度;并采用上述优化条件验证超声截留控制器灌流培养重组CHO细胞工艺。结果本实验条件下,优化后的灌流培养条件为:温度33.2℃、pH 7.0、灌流速度4.1 mL/min。3批验证结果显示,相较批培养,灌流培养时间延长5~7 d,收获体积增加5~7倍。其中,葡萄糖和乳酸含量、细胞密度和活性批间变化趋势一致;细胞截留效率均高于90%,批间差异无统计学意义(P>0.05);目的蛋白比活性约为0.5,批间差异无统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示,相对分子质量和糖基化修饰与批培养一致。结论实现了5 L生物反应器灌流培养重组CHO细胞表达gE蛋白工艺,为后续大规模生产提供了依据。