人外周血血清培养人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞

背景:细胞培养基种类甚多,成分不尽相同,对细胞生长影响较大。国内外有多项研究采用无血清、含胎牛血清的培养基进行体外扩增培养,但应用含人外周血血清的培养基将人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞以及人外周血血清促进神经干细胞分化为其他神经细胞,目前相关研究较少。目的:观察人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞的可行性。方法:①采用含体积分数10%人外周血血清的DMEM/F12培养基培养人脐带间充质干细胞,传代培养至第3代时应用流式细胞仪分析其表面标志物,并通过茜素红染色对其成骨分化能力进行检测;②取第3代人脐带间充质干细胞,加入培养体系为含0.5%N2、1.5%B27、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20 ng/mL表皮生长因子的DMEM/F12培养基定向诱导为神经干细胞,对其表面标志物进行鉴定;③取生长状态良好的人脐带间充质干细胞源性神经干细胞,制备成单细胞悬液,均匀接种于96孔板中,加入含体积分数10%人外周血血清的DMEM/F12培养液继续培养8 d后,进行苏木精-伊红染色、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色,检测神经干细胞向其他神经细胞分化情况。结果与结论:①经人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞呈漩涡状生长且多层分布,排列有方向性;人脐带间充质干细胞表面高度表达CD44、CD105、CD29、CD73,茜素红染色阳性;②人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞可以定向诱导分化为神经干细胞,神经干细胞表面高度表达CD44、CD105、CD29、CD73、Nestin、NF-L、GALC;③神经干细胞诱导分化第8天时,经苏木精-伊红染色后发现其伸出的突起长度较长,分支也较多且邻近细胞之间的突起互相连接,呈典型的神经细胞形态,且微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色均呈阳性。结果表明,人外周血血清培养人脐带间充质干细胞可以定向诱导为神经干细胞,在人外周血血清的作用下神经干细胞随着培养时间的延长,可分化为其他神经细胞。

分娩孕妇与新生儿血清钙、镁、锌、铜的含量及其相关

本文对117例分娩期孕妇及新生儿脐血进行了血清钙、镁、锌、铜含量的测定及相关分析。测定方法采用原子吸收光谱法,统计分析采用直线回归及相关。结果表明,孕妇血清钙、镁、锌的含量皆低于脐血,钙、镁含量母血与脐血呈正相关(P<0.001),而锌无相关(P>0.05),血清铜孕妇明显高于脐血,但二者无相关(P>0.05)。孕妇血清钙低于2.0mmol/L(8mg/dl)者,其新生儿脐血钙达2.0mmol/L以上者竟占91.43％,说明母体在钙量不足的情况下,仍要满足胎儿的需要。

脐带血清对造血细胞的增殖刺激作用

目的 :探讨脐带血清 (CBS)对骨髓造血细胞的效应。方法 :采用骨髓粒单系祖细胞、混合祖细胞、鹅卵石造血区、长期培养起始细胞培养法 ,在培养体系中加入CBS或 和细胞因子 (CK) ,根据培养集落的形成量 ,推算CBS中CK的含量。结果 :CBS中含有能直接刺激骨髓造血细胞形成的CK ,其中约含GM CSF 6 5 6 μg L ,IL 32 9μg L ,有较高的SCF、IL 6等活性。结论 :CBS内含有的造血刺激活性 ,可支持造血细胞体外生长、扩增 ,与CK比 ,有一定可比性及协同作用 ,具有一定应用前景。

无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究

脐血造血干细胞移植后血小板恢复延迟是一大难题 ,目前认为这主要与脐血中巨核系祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟延迟有关 ,而将部分脐血进行巨核系祖细胞体外扩增后输注受者体内是有望解决这一难题的重要途径 ,但适用于临床应用的扩增条件至今仍未确立。本课题采用人脐血单个核细胞 (MNC)在无血清培养体系中使用TPO ,IL 3,SCF ,IL 6等细胞因子进行不同的组合 ,在培养的 0 ,6 ,10 ,14天进行MNC、CD4 1+细胞及CFU MK数的检测 ,以寻找最佳的细胞因子组合及最佳的收获时机。结果表明 :无血清条件下TPO与IL 3,SCF ,IL 6等细胞因子联用可实现脐血巨核系祖细胞有效的体外扩增 ,各因子组中以TPO +IL 3+SCF +IL 6组扩增效果为最佳 ,其CFU MK数于第 10天最多 ,扩增达 6 .8倍 ,CD4 1+细胞扩增达 8.8倍。结论 :在人脐血MNC无血清培养条件下 ,TPO +IL 3+SCF +IL 6组为巨核系祖细胞体外扩增较佳的因子组合。由于TPO +IL 3+SCF +IL 6组的CFU MK数于第 10天最多 ,CD4 1+细胞数亦为同期最高 ,故培养后收获时间宜控制在其体外培养的第

人脐血清代替胎牛血清培养树突状细胞

为探讨脐血清 (umbilicalcordserum ,UCS)取代胎牛血清 (fetalcalfserum ,FCS)对体外培养体系中树突状细胞分化和功能的影响 ,用脐血清代替FCS培养树突状细胞 ,通过流式细胞术检测细胞表型和MTT法检测混合淋巴细胞反应的能力。结果表明 ,脐血清培养的DC(UCS DC)表面CD83,CD86和HLA DR的表达率明显高于FCS组DC ;而CD1a表达率低于FCS DC ;对混合淋巴细胞反应的刺激能力UCS DC与FCS DC均较对照组明显增强 ,但UCS DC与FCS DC间无明显差别。结论 :脐血清代替FCS可以产生完全不含异种蛋白、表型比含FCS体系培养的DC更成熟 ,且有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的DC。

人脐血清代替胎牛血清体外培养脐血树突状细胞

目的 探讨人脐血清取代胎牛血清对脐血来源的树突状细胞体外诱导的影响。方法 无菌采集脐血 ,密度梯度离心法获取界面细胞 ,采用Mini MACS分离技术 ,分离CD34+ 造血干细胞 ,分成 3组 :脐血清组 (加入含 10 %UCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,胎牛血清组 (加入含 10 %FCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,对照组 (含10 %FCS但不含细胞因子 )。细胞因子为IL 4、GM CSF和TNF α ,第 8天收集部分细胞做细胞表型分析、形态学观察。结果 脐血清培养的DC(UCS DC)表面CD80、CD5 4和HLA DR的表达率与胎牛血清培养DC(FCS DC)比较无明显差异 ,UCS DC、FCS DC表达率与对照组比较均明显增高。结论 脐血清代替胎牛血清体外培养脐血来源的DC前体细胞 ,可以诱导出成熟DC ,为临床应用提供了一种新的选择。

产妇血清和新生儿脐带血中总IgE与特应性皮炎的关系及过敏原检测

目的探讨产妇血清和新生儿脐带血中总Ig E与儿童特应性皮炎(AD)的相关性及过敏原检测的临床意义。方法选取2009—2011年建立的出生队列中诊断为AD的儿童35例(AD组),随机抽取未患AD的35例儿童作为对照(对照组),ELISA法分别检测儿童出生前产妇血清和新生儿脐带血中的总Ig E水平,定量免疫印迹法检测血清特异性Ig E水平。结果 AD组中母亲血清和新生儿脐带血总Ig E阳性率高于对照组(χ2分别为16.568和14.933,均P<0.01)。AD组中母亲血清过敏原中尘螨,屋尘,豚草花粉,蒿类花粉,杨、柳及榆树花粉,霉菌,虾,海洋鱼类特异性Ig E阳性率高于对照组(均P<0.05);AD组患儿脐带血过敏原中蒿类花粉,霉菌Ig E阳性率高于对照组(均P<0.05)。结论母亲血清总Ig E升高可能会对婴儿后期罹患AD起预测作用,母亲的过敏状态与婴儿的过敏状态无明显一致性。

人脐血树突状细胞体外无血清培养

树突状细胞(dendritic cell,DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞,已试用于肿瘤的免疫治疗,但多数实验室培养DC的体系中包含血清,使其临床应用受到限制。本研究以人脐血为来源,建立了无血清培养DC体系,以期将来用于临床。首先,用rhGM-CSF加rhTNF-α,进行有血清液体悬浮培养,14天后,从(1±0.5)×10~4/ml CD34^+细胞或(5±2)×10~5/ml单个核细胞中,总细胞数扩增5倍,DC分别占(25±5)％和(17±5)％。第二,以无血清培养基代替有血清培养基,培养21天,(2±1)×10~6/ml单个核细胞没有数量的扩增,DC占(7±2)％。最后,对上述培养体系,在第5天(有血清培养基)或第12天(无血清培养基)后加入rhIL-4,DC产率及细胞总数均未增加。本研究结论:①根据液体悬浮培养中观察到粒、巨噬细胞和DC的混合集落及DC小丛,证实DC与粒、巨噬细胞有共同祖先,均来源于CD34^+造血干/祖细胞;②脐血单个核细胞虽较CD34^+细胞产生DC的比率稍低,但分离方便,花费少;③无血清体系的培养效果不如有血清体系,培养所需时间也长,细胞产率也低,有待进一步完善;④未证实rhIL-4能增加DC产率。

自体血清培养人脐血间充质干细胞的实验研究

本实验采集脐血并分离脐血单核细胞与血清,分别用胎牛血清与自体脐血血清培养人脐血间充质干细胞。通过检测所培养出的成纤维细胞样细胞的表面抗原标记与细胞的成骨、成脂和成心肌细胞分化能力,鉴定所培养的细胞是否为间充质干细胞。成功采集的21例脐血中,有11例用胎牛血清和15例用自体血清培养出了间充质干细胞,表达细胞表面抗原标记CD29、CD44、CD105,不表达CD34、CD45,并成功地诱导成成骨细胞,脂肪细胞和心肌样细胞,说明使用自体血清培养脐血间充质干细胞较使用胎牛血清有较高的成功率,而且,自体血清培养的脐血间充质干细胞也能成功的进行多向诱导分化。

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的:探讨以人骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSC)为基质的无血清培养方法,体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells,CBSC),研究BM-MSC支持造血的功能,以能最终用于临床。方法:用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、flt3/flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的无血清培养液,比较有或无MSC条件下,体外扩增脐血CD34+细胞两周后检测总细胞TC、CD34+细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC-IC)增加倍数。结果:在TPO、FL、SCF和G-CSF的作用下,经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34+细胞、CFU-GM、CFU-C和LTC-IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组,TC、CD34+细胞、CFU-GM、CFU-C数分别增加了62、11、25、24倍,但LTC-IC只有扩增前的0.8倍。结论:以人BM-MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC,有潜在的临床应用价值。

脐血CD34^+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究

脐血是造血祖细胞的丰富来源之一,选择合适的培养条件,体外诱导其定向扩增为红系祖细胞,输入体内产生成熟红细胞。本实验旨在探讨脐血单个核细胞(MNC)体外红系定向扩增的理想因子组合(Flt3配基FL联合TPO、SCF、EPO及FL、SCF、TPO)对CD34+细胞扩增的影响。将单个核细胞接种至stemspan无血清培养液中,共分3组:A组为对照组,B组为TPO+SCF+FL+EPO+IGF1组,C组为TPO+SCF+FL组,C组在第6天及以后换液加入EPO和IGF1。于培养0、6、10、14天进行细胞计数,细胞集落测定,流式细胞术测定细胞的CD34、CD34CD71、CD71GPA细胞的比例。结果表明:经10天培养后,B组总细胞数扩增6.89倍,而C组3.06倍;B组CD34+细胞增加4.83,而C组2.47倍;B组集落形成细胞数增加4.3倍,而C组增加2.5倍;B组红系祖细胞BFUE和CFUE数增加5.4倍,而C组3.1倍;B组CD34+CD71+细胞数增加8.72倍,而C组3.37倍;B组CD71+GPA+细胞数增加53.4倍,而C组30.29倍。结论:脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO实现了CD34+细胞及集落形成细胞的扩增。脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO+EPO+IGF1短期液体培养获得红系祖细胞的扩增,在第0天比6天加入EPO获得更多红祖细胞(P<0.05)。由于TPO+SCF+FL+EPO+IGF1组的集落形成细胞数、CFUE和BFUE数于第10天最多。

妊娠期糖尿病孕妇血清及脐血中preptin的水平

目的探讨妊娠期糖尿病患者与正常健康孕妇血清及脐血中preptin水平变化及其在妊娠期糖尿病发病过程中的作用。方法选取妊娠期糖尿病患者(GDM组)33例,正常妊娠组(NGT组)33例,用ELISA方法测定preptin的浓度、空腹血糖、空腹胰岛素(FINS)、血脂,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及记录体重、年龄、孕周、新生儿出生体重、阿氏评分。结果 GDM组血清及脐血preptin水平明显高于NGT组(P<0.01);孕妇preptin浓度与孕妇年龄、FINS、糖筛后1h血糖水平、脐血preptin呈正相关(P<0.05)。孕妇及脐血preptin与新生儿参数无相关性(P>0.05)。空腹血清preptin与胰岛素呈正相关(P<0.05)。结论妊娠期糖尿病患者血清preptin水平升高,可能为早期检测妊娠期糖尿病提供一种新的方法。

混合脐血血浆用于CD3AK细胞培养的研究

目的 :观察比较混合脐血血浆和成人 AB血清在 CD3AK细胞培养中的作用效果。方法 :分别用混合脐血血浆和成人 AB血清培养 CD3AK细胞 ,检测两组细胞的增殖特性、杀伤活性及免疫表型。结果 :混合脐血血浆组的增殖倍数略低于血清组 ,对 K5 6 2、HL - 6 0的杀伤活性则稍高于血清组 ,但差异均无显著性意义 (均为 P >0 .0 5 ) ;两组的免疫表型都以 CD3+、CD8+为主 ,亦无显著性差异 ( P >0 .0 5 )。结论 :混合脐血血浆在 CD3AK等免疫效应细胞的培养中可能和成人

母血、脐带血及羊水IL-6水平预测亚临床宫内感染的对比分析

目的评价并对比母血、脐带血及羊水中IL-6水平对亚临床宫内感染的预测价值。方法选择在笔者所在医院择期剖宫产分娩并诊断为亚临床宫内感染的68例孕妇作为本次研究的病例组,未诊断有亚临床宫内感染的100孕妇作为对照组。用Elisa的方法分别测量两组母血、脐带血及羊水的IL-6水平,并通过绘制ROC曲线的方法评价不同生物标本IL-6水平预测亚临床宫内感染的效果。结果母血、脐带血和羊水中IL-6水平预测亚临床宫内感染的灵敏度分别为68.00%、74.50%和77.50%,特异度分别为89.00%、85.50%和87.50%。结论三种体液IL-6预测亚临床宫内感染的效果均较好,并以羊水IL-6预测亚临床宫内感染的价值最高。

人骨髓间充质干细胞联合细胞因子的无血清培养体系体外扩增脐血干细胞研究

目的 探讨以人骨髓间充质干细胞 (BM MSC)为基质的无血清培养方法 ,体外扩增脐血造血干细胞 (CBSC) ,研究BM MSC支持造血的功能和体外扩增时间的选择。方法 用含血小板生成素 (TPO)、干细胞因子 (SCF)、flt3/flk2配体 (FL)和粒细胞 集落刺激因子 (G CSF)的无血清培养液 ,以人BM MSC为基质 ,比较体外扩增脐血CD34+ 细胞 7d及 14d后总细胞 (TC)、CD34+ 细胞和集落形成单位 (CFU)数增加倍数。结果 在以人BM MSC为基质及TPO、FL、SCF和G CSF这四种细胞因子作用下 ,经体外扩增 7d后TC、CD34+ 细胞、CFU GM和CFU C数较起始分别增加了87、16、15和 2 6倍 ;14d后较起始分别增加了 4 2 7、38、12 5和 10 4倍 ,与 7d扩增倍数有显著性差异。结论 以人BM MSC为基质的无血清体外培养体系可以有效扩增CBSC ,有潜在的临床应用价值 ,扩增时间应以

妊娠妇女血清脂类及氧化型低密度脂蛋白浓度的动态变化和脐血血脂特征

目的国内外已有针对病理妊娠中血脂异常表现的相关研究。文中研究正常中晚期妊娠妇女血清脂类、氧化型低密度脂蛋白(oxidated low-density lipoprotein,Ox-ldl)及脐带血Ox-ldl的变化。方法选择50例正常妊娠妇女中期妊娠开始的5个不同时间点采取静脉血样,同时收集新生儿脐带血,正常非孕健康妇女20例作对照组。采用聚合免疫酶联吸附试验(enzyme-linked immunosorborbent assay,ELISA)方法对各指标进行检测。结果中晚孕期总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-c)较对照有明显增高;脂蛋白a(lipoprotein a,Lpa)值在孕37周较非孕状态下有显著升高;总抗氧化能力(total anti-oxidant capacity,T-AOC)在分娩前明显增高。新生儿脐带血中除TG与成人无明显差异外,其余各项指标TC、HDL-c、LDL-c、Lpa均偏低,但T-AOC在脐带血中水平明显偏高。结论正常妊娠中晚期血清脂质较对照组变化较大,新生儿脐带血中主要指标和成人差异明显。

脐血浆分离培养人脐带间充质干细胞

目的：利用脐带血血浆分离、培养人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）。方法：将脐血浆经盐析、透析等处理后，按10％体积成分分离、培养扩增HUCMSCs，观察细胞的形态，流式细胞仪检测细胞表面标志，MTT法检测细胞生长曲线、增殖能力，ELISA检测培养液中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、noggin的分泌浓度。结果：利用含10％脐带血血浆的培养液能分离、扩增HUCMSCs，分离纯化的HUCMSCS成梭形、增殖能力强、具有分化为成骨细胞、脂肪细胞及神经干细胞的能力，高表达CD29、CD44，低表达或不表达CD34、CD45及HLA_DR。而且在含10％脐带血血浆的培养液中生长的HUCMSCs还能分泌人胚胎干细胞（hESC）生长所需的的bFGF及noggin。结论：脐带血血浆经简单处理后能分离培养HUCMSCs，而且其分泌的细胞因子更适合hESC培养需要。

脐带血血清中六种微量元素含量的研究

本文对100例健康胎儿脐带血血清中六种微量元素（锌、铁、铜、钙、镁、锰）含量进行了测定。结果提示，所测的六种元素含量在男、女性胎儿之间似无明显差异（P＞0．05）；与成人比较，胎儿的锌、铁、锰含量高于成人，铜、钙含量低于成人，侯含量与成人相近。

脐带血清在骨髓造血祖细胞培养中的效应

目的 :探讨人脐带血清 (CBS)在骨髓造血祖细胞培养中的效应。方法 :用人骨髓细胞进行CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM培养。结果 :CBS能直接刺激骨髓细胞CFU GM的形成。与血型相同否无关。四人份以上的混合CBS(MCBS) ,刺激活性高且稳定。 1 0 %MCBS相当于 6 5 .6 μg/LGM CSF、0 .2 3、0 .3、0 .46kU/LEpO对CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM所起的作用。MCBS可提高CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM常规体系的集落产率。在CFU GM培养时 ,2 0 %MCBS与 1 0 0 μg/LGM CSF和 2 0 %马血清具有相同的效果。MCBS可直接刺激CFU E形成。如培养体系内无BpA存在时 ,形成BFU E、CFU GEMM较少或几乎为零 ,当含BpA时 ,可形成一定量的BFU E、CFU GEMM集落。结论 :CBS(MCBS)内 :①含有GM CSF、Epo等物质或因素 ;②具有刺激CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM的生长活性 ;③同血型或不同血型 4人份以上混合 ,刺激活性高且稳定。具有良好的应用前景。

不同浓度补肾中药血清对人脐血间充质干细胞成骨活性的影响

目的观察不同浓度补肾中药血清对人脐血间充质干细胞体外成骨活性的影响,探讨中药血清浓度与成骨分化能力的相关性。方法制备低、中、高浓度补肾中药大鼠血清,培养第3代人脐血间充质干细胞,按诱导分化培养基中加入中药血清浓度的不同及是否联合骨形态蛋白(BMP-2),分为基本培养基组(对照组)、5%中药血清组、10%中药血清组、15%中药血清组、5%中药血清+BMP-2组、10%中药血清+BMP-2组、15%中药血清+BMP-2组及BMP-2组,分别观察各组碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(BGP)含量及钙离子浓度变化。结果低、高、中不同浓度中药血清组分别在诱导第6、9天及第3、6天可提高ALP活性,10%中药血清组在诱导第9、12天能提高细胞内BGP含量,而中药血清联合BMP-2后,ALP活性及BGP含量明显提高,尤其以5%低浓度联合组为明显。各组成骨诱导第21天以激光共聚焦显微镜扫描细胞内钙离子浓度变化,5%中药血淸+BMP-2组、BMP-2组的荧光强度明显强于其他各组,且5%中药血淸+BMP-2组荧光强度最为明显。结论不同浓度补肾中药血清单独诱导人脐血间充质干细胞成骨分化作用较弱,但联合BMP-2后均能不同程度提高人脐血间充质干细胞成骨活性,尤其以5%低浓度补肾中药血淸为佳,且具有一定的协同促进作用。