牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。

丙型肝炎病毒Core蛋白类病毒颗粒的表达及纯化

目的通过PCR将丙肝病毒(HCV)Core与蜂毒素信号肽(Mel)进行融合,构建到pIZ/V5载体上获得pIZ/V5-Core-Mel表达载体。方法将pIZ/V5-Mel-core稳定转染Sf9细胞,经Zeocin抗性筛选,获得单克隆抗性细胞株。RT-PCR检测结果表明获得稳定表达Mel-core的细胞系Sf9-Core。对稳定细胞系Sf9-Core的上清进行离心纯化并Western印迹检测。结果在上清离心纯化的样品中有HCV Core形成的类病毒颗粒(VLPs)。透射电镜显示Core蛋白能自组装成直径约30 nm的球形颗粒。结论该研究成功构建了HCV Core与蜂毒素信号肽的融合蛋白并在Sf9细胞稳定表达,在细胞培养的上清中获得了VLPs。

猪瘟病毒Core蛋白核仁定位序列鉴定

黄病毒科病毒核衣壳蛋白的核仁定位在病毒颗粒包装与病毒复制中发挥重要作用。为鉴定黄病毒科的猪瘟病毒Core蛋白核仁定位序列,本研究构建了将Core蛋白、截短突变体和氨基酸位点突变体分别与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达质粒,转染至PK15细胞后进行表达和定位分析,结果显示Core蛋白核仁定位序列为PESRKKL,其关键氨基酸为R76K77,对理解猪瘟病毒Core蛋白结构与功能和为后续研究Core蛋白在病毒复制及颗粒包装中的作用有重要意义。

猪瘟病毒Core蛋白的原核表达和抗体制备及应用

根据猪瘟病毒衣壳蛋白(Core)基因序列设计一对特异性引物,RT-PCR从猪瘟兔化弱毒中扩增出完整的Core基因,经酶切和序列测定后,克隆到携带His标签的原核表达载体p ColdⅠ中,成功构建了重组质粒p Cold-Core,并转化到大肠杆菌Rosseta 2(R2)中;利用IPTG诱导表达目的蛋白并鉴定表达效果。结果表明:经终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导24 h后,Core基因在R2中获得分泌性可溶表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量为20 ku。Western blot结果显示Core蛋白可以分别与His单抗和猪瘟病毒阳性抗血清发生特异性反应,均出现单一反应带。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备特异性抗血清,Western blot结果显示该抗血清与衣壳蛋白反应后有明显的特异性条带,经激光共聚焦鉴定抗血清能够与胞浆中的猪瘟病毒粒子发生反应。结果表明,Core基因表达成功,制备的抗血清具有生物学功能。本研究为深入探讨Core蛋白在猪瘟病毒致病机制上的作用奠定了基础。

脂滴在丙肝病毒生命周期中的作用

脂滴是细胞内中性脂的主要储存细胞器。最近许多研究都发现脂滴与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)有着密切的关系。脂滴对HCV的生命周期发挥着重要作用,影响HCV的感染、复制、组装和分泌一系列生命过程。本文就脂滴在病毒生命周期中的作用的最新进展进行综述。