多房棘球绦虫角化蛋白的基因克隆、表达及免疫反应性分析

目的克隆表达多房棘球绦虫角化蛋白(EmCNFN)基因,并分析其免疫反应性。方法以细粒棘球绦虫CNFN氨基酸序列为探针,通过电子克隆方法获得EmCNFN基因cDNA全长。设计EmCNFN特异性引物,PCR扩增EmCNFN基因,并进行菌落PCR和测序验证。构建pET32a-EmCNFN原核表达载体,筛选IPTG最适诱导浓度和最适诱导时间进行诱导表达,制备EmCNFN重组蛋白。通过Ni柱层析获取高纯度的EmCNFN重组蛋白。分别用His标签抗体、泡球蚴病患者血清、健康人血清和泡球蚴感染SD大鼠血清、健康SD大鼠血清作一抗,Western blot分析EmCNFN重组蛋白免疫反应性。采用生物信息学软件分析EmCNFN蛋白潜在B、T细胞表位。结果成功获得EmCNFN基因cDNA全长,PCR试验和测序验证其序列正确。优化的IPTG最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最佳诱导时间为8 h。原核表达后通过Ni柱层析,获得了高浓度高纯度的40 ku EmCNFN重组蛋白。Western blot显示,EmCNFN重组蛋白可与His标签抗体、泡球蚴病患者血清和泡球蚴感染SD大鼠血清发生特异性反应。生物信息学软件分析发现,EmCNFN蛋白含有4个潜在B细胞表位,8个潜在T细胞表位。结论成功获得EmCNFN基因cDNA序列,克隆表达、纯化了EmCNFN重组蛋白,该蛋白含有B、T细胞表位,具有免疫反应性,为进一步研究其功能奠定了基础。