佛波酯诱导C2C12肌管自噬及corylifol A的保护作用研究

目的:探索佛波酯(PMA)诱导C2C12肌管自噬的作用机制并考察补骨脂成分次苷酸查尔酮(CYA)对肌管的保护作用。方法:构建能够准确分析细胞自噬状态的mRFP-GFP-LC3B双荧光C2C12成肌细胞,将已分化C2C12细胞分为对照组、PMA组(1μmol/L)、自噬阳性对照组(饥饿组)、CYA组(10μmol/L)及PMA+CYA组。处理时间为48 h。Cytation 5测定细胞在不同波长下的荧光强度,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1及微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)的表达水平,qPCR技术检测蛋白激酶C(PKC)-ε、PKC-β,PKC-θ和缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)的表达水平。用海马能量代谢分析仪(Seahorse XFe 24分析仪)检测细胞线粒体呼吸能力。结果:(1)与对照组比较,PMA(1μmol/L)可使C2C12肌管的黄色荧光斑点显著增加,红色荧光信号强度也显著增强(P<0.01),即自噬及自噬溶酶体均增加。而CYA(10μmol/L)可以显著降低PMA诱导的C2C12肌管黄色荧光斑点和红色荧光信号强度(P<0.01)。(2)与对照组比较,PMA可以上调Beclin-1和LC3BⅡ蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01);与PMA组比较,PMA+CYA组可以降低自噬相关蛋白Beclin-1及LC3BⅡ的蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。(3)与对照组比较,PMA显著降低C2C12肌管的基础呼吸、最大呼吸和ATP的生成(P<0.01)。(4)与对照组比较,PMA组可以显著上调PKC-ε、PKC-β、PKC-θ和HIF-2α基因表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:PMA可能通过激活C2C12肌管的PKC通路来抑制细胞线粒体呼吸,促进HIF-2α的表达,HIF-2α上调自噬相关蛋白Beclin-1和LC3BⅡ的表达,从而诱导C2C12肌管自噬。CYA则可能通过下调Beclin-1和LC3BⅡ的蛋白表达来保护肌管对抗PMA诱导的自噬。

补骨脂4种组分对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症因子的影响

目的探讨补骨脂4种组分补骨脂素、corylifol A、新补骨脂异黄酮、补骨脂酚对巨噬细胞RAW264.7细胞炎症因子的影响。方法 ELISA法测定补骨脂4种组分对LPS刺激RAW264.7细胞TNF-a,IL-1β,IL-6分泌的影响及雌激素受体抑制剂(ICI 182.170)的拮抗作用。结果与正常对照组比较,脂多糖(LPS)组可以显著升高RAW264.7细胞表达TNF-α,IL-1β,IL-6(P<0.05);corylifol A、补骨脂酚在10μmol.L-1浓度下能显著降低TNF-α的分泌(P<0.05);补骨脂素、corylifol A、新补骨脂异黄酮在10μmol.L-1浓度下能显著降低IL-1β的分泌(P<0.05);corylifol A、新补骨脂异黄酮、补骨脂酚在10μmol.L-1浓度下显著降低IL-6的分泌。补骨脂4种组分的抗炎作用与补骨脂雌激素样活性无关。结论补骨脂4种不同组分对LPS刺激引起的炎症因子的释放有抑制作用,其抗炎作用与雌激素受体样活性无关。

大孔吸附树脂结合斑马鱼评价富集纯化补骨脂总黄酮的工艺研究

目的研究大孔吸附树脂法结合斑马鱼评价富集纯化补骨脂总黄酮的制备工艺。方法以补骨脂的黄酮类代表成分(新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂二氢黄酮甲醚和corylifol A)为指标,考察不同类型大孔吸附树脂的静态、动态吸附和解吸附能力,优选大孔吸附树脂类型;综合斑马鱼形态变化和存活率,评价大孔吸附树脂有机溶剂残留的安全性,优选不同厂家大孔吸附树脂;进一步考察上样药液质量浓度、体积流量、上样量、吸附时间、洗脱剂乙醇体积分数和用量等因素对黄酮纯化工艺的影响,并对优选纯化工艺进行验证,比较大孔吸附树脂纯化前后新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂二氢黄酮甲醚、corylifol A、补骨脂宁、补骨脂定、补骨脂乙素、4′-O-甲基补骨脂查耳酮、补骨脂素和异补骨脂素(黄酮类和香豆素类),以及补骨脂酚的含量。结果优选出D101大孔吸附树脂对补骨脂黄酮成分同时具有较好的吸附能力和解吸附能力;10个厂家D101大孔吸附树脂醇浸液对斑马鱼形态和致死率的影响差别较大,其中D2和D5的大孔吸附树脂安全性较好。优化的D101大孔吸附树脂纯化总黄酮制备工艺为补骨脂药液上样质量浓度为0.5 g/mL生药,上样量为1倍柱体积(BV),上样体积流量为1 mL/min,吸附时间为1.5 h,用1 BV 30%乙醇洗去未被吸附的成分,再用4 BV 90%乙醇洗脱黄酮成分,所得补骨脂总黄酮提取物中8种黄酮成分含量约是纯化前的1.3~5.1倍,黄酮成分总量约占上述所测11种成分总量的93.6%,提取物中总黄酮质量分数约为54%。结论斑马鱼评价可快速辨别大孔吸附树脂的安全性差异,D101大孔吸附树脂可有效富集纯化补骨脂黄酮类成分,优选的工艺简单、稳定、重复性好。

补骨脂炮制前后水煎液致雌性ICR小鼠胆汁瘀积性肝损伤作用比较

目的探讨补骨脂炮制前后致雌性ICR小鼠胆汁瘀积性肝损伤的差异。方法采用高效液相色谱仪检测补骨脂炮制前后化学成分含量变化。雌性ICR小鼠连续30 d ig生、盐补骨脂水煎液,末次给药24 h后,取血清,采用全自动生化仪检测肝损伤相关指标丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和总胆红素(total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)、总胆汁酸(total bile acid,TBA)水平;取肝脏、脾脏和肾脏,称定质量并计算脏器指数,采用苏木素-伊红(HE)染色法进行肝脏病理组织学检查;采用ELISA法检测血清中雌二醇(estradiol,E2)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)以及肝脏中法尼醇受体(farnesoid X receptor,FXR)、雌激素硫酸转移酶1E1(sulfotransferase 1E1,SULT1E1)和E2含量。结果补骨脂经盐炙后补骨脂苷、异补骨脂苷、新补骨脂异黄酮含量下降,其余8种成分含量均升高,其中补骨脂素、异补骨脂素、corylifol A升高较为明显。雌性小鼠ig生、盐补骨脂水煎液30 d后出现生殖器损伤,小鼠阴道口红肿,有水样浸润。与对照组比较,生、盐补骨脂组小鼠血清ALT、AST、ALP活性及DBIL、TBIL、TBA水平均显著升高(P<0.05、0.01、0.001),盐炙后补骨脂致肝损伤较生品更严重;肝脏FXR、SULT1E1含量显著降低(P<0.01、0.001),血清E2、FSH、IL-6和肝脏E2含量均显著升高(P<0.05、0.01、0.001)。盐补骨脂与生补骨脂比较,IL-6升高更明显,FXR、SULT1E1下降更明显。结论补骨脂素、异补骨脂素和Corylifol A可能是补骨脂药效成分同时也可能是其主要毒性成分,盐补骨脂较生补骨脂更易造成肝损伤。