观光木cpDNA非编码序列PCR反应体系优化及引物筛选

利用单因素与正交设计试验,对影响观光木cpDNA-PCR扩增的主要因子进行优化,建立了观光木cpDNA-PCR最适反应体系(20μL),为:50 ng模板DNA、1×PCR buffer、0.2μmol·L-1引物、2 mmol·L-1MgCl2、0.3 mmol·L-1dNTP以及1 U Taq DNA聚合酶;筛选出了适合观光木分子谱系地理学研究的非编码区序列引物,为rpl32-trnL、psbJ-petA、3′rps16-5′trnK、atpI-atpH、petL-psbE。

珙桐cpDNA非编码序列引物反应条件优化与筛选

实验采用改良CTAB方法提取总DNA,以珙桐及其近缘种基因组DNA为材料,优化cpDNA非编码序列PCR扩增条件,优据优化的PCR扩增条件,首次筛选出适合于珙桐分子谱系地理学研究的cpDNA非编码序列和引物。结果表明:25μL PCR反应体系中含有50 ng DNA,10×Buffer,2.5 mmol MgCl2,0.4 mmol dNTPs,0.2μmolpri mer1,0.2μmol pri mer2,1.25 U Pfu DNA Polymerase。适宜的PCR反应程序为94℃5 min,94℃1 min,退火时间45 s,退火温度和72℃延伸时间依不同的引物和产物而不同,35个循环,72℃总延伸7 min。稳定性好的、扩增条带清晰且单一的trnSGCU和trnGUUC、F71和R1516、rps16—F和rps16—R、atpB—49和rbcL—188四对引物可作为进一步珙桐分子谱系地理学研究的引物。

基于cpDNA trnL-F序列数据分析海南陆均松种群的冰期后扩张

针对热带树种陆均松Dacrydium pierrei de Laubenfels分布在海南的12个天然种群进行取样,测定了叶绿体DNA(cpDNA)trnL-F非编码区序列。序列长度介于868—876 bp.显示出长度多态性。碱基组成A+T含量较高,百分比值为64.17%-64.95%。通过统计简约算法共鉴定出30个单倍型。根据种群间分化度FST(=0.00)、基因流Nm(介于1.92—2.50)、AMOVA(24.17%的遗传变异发生在种群间,P>0.05)以及邻接树中单倍型的分支式样,发现海南的陆均松种群尚未发生遗传分化。另一方面,依统计简约算法构建的单倍型网图具“星状”特征,而且邻接树中多数单倍型合并于树的顶端。这些基因谱系结果提示海南陆均松种群在近期历史上发生过种群扩张。Tajima的D检验和错配分析结果也支持这种推测。结合地质和古孢粉学证据,认为残存于“避难所”的陆均松种群在全新世时,伴随全球气候转暖,在海南岛内可能实行了扩张。

真鲷转铁蛋白基因的克隆与表达特征分析

采用同源克隆的方法,根据相近物种转铁蛋白(Transferrin, TF)基因的序列设计简并引物,在经感染真鲷的cDNA上进行PCR扩增,获得了真鲷TF的全基因编码序列(GeneBank Accession No.AY335444).该序列由2444bp核苷酸组成,含31 bp 5′非编码区和340 bp 3′非编码区以及2073 bp的开放阅读框,可编码691个氨基酸,预测分子量约为74.3kD,等电点为5.63.同源性分析表明,真鲷TF与鱼类TF的相似性很高,约为65%～75%;与哺乳类转铁蛋白和乳铁蛋白的相似性约40%～50%;与脊索动物海鞘和无脊椎动物昆虫也有一定的相似性.进化分析表明,该基因是转铁蛋白而不是乳铁蛋白.真鲷TF与其它动物TF结构相似,是由两叶相似的结构域构成的单一肽链;该基因有一信号肽序列,缺乏糖基化位点,在它的两个结构域上,分别有三个TF家族的标签序列及一个MHC分子标签序列;与哺乳类相比,参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点高度保守.RT-PCR结果显示,真鲷TF在肝脏成组成型表达,但在其它组织中的表达可受病原调控,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多.