基于全基因组测序分析1起产气荚膜梭菌导致的腹泻暴发事件

目的对1起产气荚膜梭菌导致腹泻暴发事件进行病原学分析。方法采集病例肛拭子样本和环境涂抹样本,肛拭子样本增菌前后分别进行产气荚膜梭菌plc和cpe基因荧光PCR检测和产气荚膜梭菌分离培养,对分离菌落进行全自动生化鉴定和飞行时间质谱鉴定。对鉴定为产气荚膜梭菌的分离株进行全基因组测序,分析菌株携带毒力基因和耐药基因情况,基于全部分离株核心基因组单核苷酸多态性进行遗传聚集性分析。结果未增菌的病例肛拭子cpe和plc基因检出率分别为46.15%(6/13)和53.85%(7/13),基于BHI厌氧增菌后病例肛拭子cpe和plc基因检出率分别为38.46%(5/13)和53.85%(7/13);10名病例肛拭子分离到产气荚膜梭菌,均为F生物型(携带毒力基因分布plc+/cpb-/etx-/iA-/cpe+/cpb2+/netB-),10个分离株基于cgSNP构建的聚类树形成2个相互独立且遗传距离较远的分支,Lineage 1仅分布1株,为ST589,携带耐药基因为erm(Q),Lineage 2分布9株,为ST149,携带耐药基因为tetB(P),为一组高度克隆化的菌株。结论本次暴发事件由F型产气荚膜梭菌所导致,且多数病例感染一组cpe+高度克隆化菌株。全基因组测序技术可应用于产气荚膜梭菌暴发事件病原学分析,基于肛拭子样本的产气荚膜梭菌增菌方法和分子筛查方法有待开发和应用。

层理鞭枝藻藻蓝蛋白β亚基的体内重组

为研究藻蓝蛋白β亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pET-cpcB(C155I)、pCDFDu-et-cpeS和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpeS、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和藻蓝蛋白β脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)共同转入大肠杆菌.通过色素蛋白锌电泳和光谱检测,结果表明产生了有生物活性的CpcB(C155I)-PCB.而在裂合酶基因cpeS不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有7.6%的CpcB(C155I)-PCB产生.实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白β亚基84位半胱氨酸残基与PCB连接,为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础.

免疫鸡羽毛根中火鸡疱疹病毒的分离与鉴定

用常规剂量的商用火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）冻干苗经腹腔免疫１日龄非免疫鸡，于第３周采集羽毛根，分别采取直接法和间接法（即经过滤获取脱细胞的游离物）接种次代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），以进行病毒的分离。结果显示，在免疫后第３、４、５、６周，２种方法都分离到病毒，第７周仅直接法分离到病毒，而第８周２种方法都没有分离到。根据分离到病毒的细胞病变（ＣＰＥ）特征，结合地高辛标记的Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ－１）核酸探针检测结果，表明ＨＶＴ免疫鸡羽毛根中含有可脱离细胞的、具有感染性的疫苗株ＨＶＴ粒子，且其可检出时间具有阶段性。

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖

本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的干扰作用。筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究。成功观测到由载体表达的小干扰RNA(siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象。通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据。证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖。实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路。

表达HAV结构基因的重组腺病毒鉴定及细胞病变分析

利用RT-PCR方法,从HAV-L8株的RNA中扩增出结构基因(vp3+vp1),克隆到穿梭质粒pXCX2NotI上。采用磷酸钙-DNA共沉淀技术,将腺病毒载体pJM17与pXCX2-CMV-HAV共转染293细胞。在光学显微镜下观察到明显的细胞病变(CPE);经RT-PCR、免疫荧光染色和蛋白印迹鉴定证明HAV的结构基因已插入到腺病毒基因组中;在电子显微镜下观察发现有二十面体的病毒颗粒。以上结果表明获得了重组腺病毒rAdHAV,纯化后的rAdHAV滴度为1×109.0TCID50/mL。

产气荚膜梭菌肠毒素的分子生物学研究进展

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病的病原体,它是一类革兰氏阳性产芽孢的厌氧梭菌,可引起人的食物中毒和肠毒素相关腹泻。近年来,研究人员发现由产气荚膜梭菌导致腹泻的主要原因与该菌在芽孢形成过程中产生的一种肠毒素有关。文章重点针对产气荚膜梭菌肠毒素的生物学特性和致病机制等方面的研究做一综述。

云南香猪PRRSV分离株ORF7基因遗传变异分析

为了解2014年云南省香猪群体中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特征,将疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病例肺脏和淋巴结研磨处理后接种Marc-145细胞进行盲传,传至第2代48 h时出现2株病毒致Marc-145细胞聚集融合、巨细胞等病毒致细胞病变(CPE)效应现象,将其命名为YN-2XZ1和YN-3XZ2。细胞冻融3次后,使用Reed-Muench法计算病毒的半数感染力(TCID_(50))分别为10^(6.75),10^(6.05)TCID50/100μL。对ORF7基因进行序列测定、分析及N蛋白的免疫印迹(WB)检测,并与美洲经典毒株VR-2332、国内2001-2014年部分序列进行比对结果显示,本次获得的2株PRRSV之间核苷酸同源性为100%,与国内流行的变异毒株进化同步,说明目前云南香猪群中PRRSV以变异毒株为主,可能不具有高暴发性和高致病力,不会引起重大经济损失和社会恐慌,但仍需对此加以关注。通过磷酸化分析得出,暴发HP-PRRSV前N蛋白35位丝氨酸磷酸化概率67.4%~99.8%,暴发HP-PRRSV后N蛋白35位丝氨酸磷酸化概率低于50%,提示该位点氨基酸不易于磷酸化可能与NSP-2蛋白基因缺失从而引起HP-RRSV有关,需进一步研究验证。

A型产气荚膜梭菌KdpD/E双组份系统调节毒素基因表达的研究

目的 明确kdpD基因编码的蛋白结构特点,探究A型产气荚膜梭菌中KdpD/E系统与alpha和cpe毒素基因表达趋势的关联性。方法 用试剂盒法提取A型Cp菌的基因组DNA,PCR扩增kdpD基因并测序,对该基因测序结果进行分析及蛋白结构预测;分别提取A型产气荚膜梭菌培养2-9 h 8个时间段的总RNA,采用电泳和核酸蛋白检测仪,测定各个时间段总RNA的浓度和纯度;将RNA反转录为cDNA,用实时荧光定量PCR检测kdpD、kdpE双组份系统与alpha、cpe毒素编码基因的相对表达量。结果 生物信息学预测KdpD蛋白结构中α-螺旋占76.1%,β-折叠占23.1%,β-转角占0.855%,无规则卷曲占0.427%,无跨膜区;提取总RNA的质量较高,其A_(260)/A_(280)值在1.8~2.1之间;实时荧光定量PCR检测kdpD、kdpE、alpha、cpe基因扩增产物溶解曲线单一,同时kdpD/E基因与alpha和cpe毒素基因表达趋势相似,即随着细菌的生长,信号基因和毒素基因的表达量均增加,且在3 h和4 h增幅明显,并在4 h时表达量最高,随后逐渐降低,其中alpha毒素基因表达量的变化更为明显。结论 产气荚膜梭菌kdpE基因的蛋白结构预测符合其作为应答调节蛋白的结构功能,A型Cp菌中KdpD/E双组份信号系统与alpha和cpe毒素基因的表达存在一定的相关性,alpha毒素作为A型产气荚膜梭菌产生的主要毒素与KdpD/E系统的相关性更显著。