鼠伤寒沙门菌cpxR基因缺失株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

为研究鼠伤寒沙门菌双组分信号系统的应答调节蛋白基因cpxR对菌株药物敏感性的影响,本研究以p KD4质粒为模板,利用PCR扩增两侧与cpxR基因上下游同源且含有卡那霉素抗性(kanr)基因的线性打靶DNA片段,在p KD46质粒的辅助下进行Red同源重组,利用线性打靶DNA片段替换鼠伤寒沙门菌CVCC541(JS)株的cpxR基因,再利用p CP20质粒消除FRT位点间的kanr基因,构建基因缺失株JS△cpxR。并将重组表达质粒p BAD-cpxR转化于JS△cpxR中,制备回补菌株JS△cpxR/pcpxR。利用微量稀释法测定12种代表性抗菌药物对亲本株JS、JS△cpxR和回补菌株JS△cpxR/pcpxR的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、头孢噻呋(CEF)和头孢曲松(CRO)对亲本株JS的MIC值分别为JS△cpxR的4、4、4和2倍;而随诱导剂L-阿拉伯糖浓度的增高,这4种药物对回补菌株JS△cpxR/pcpxR的MIC值均逐渐恢复到亲本株JS的水平,呈剂量依赖性关系,而且高浓度诱导时4种药物对回补菌株的MIC分别为JS△cpxR的16、8、8和16倍,其他药物的MIC值未出现明显的变化。本研究结果表明:cpxR能够调控鼠伤寒沙门菌对GEN、AMK、CEF和CRO的敏感性。

cpxR基因缺失对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力的影响

为研究双组分信号转导系统CpxAR对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力的调控作用,以鼠伤寒沙门菌的标准菌株JS和构建的cpxR缺失株JSΔcpxR、以及前期研究临床分离的6株鼠伤寒沙门菌和构建的6株cpxR基因缺失株为研究对象,首先采用PCR的方法对菌株的cpxR基因进行扩增鉴定,然后采用结晶紫染色法测定各菌株的生物被膜形成能力,最后分析cpxR基因缺失前后鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力的变化。结果发现,所有亲本株和cpxR基因缺失株的cpxR基因PCR扩增条带大小与预期一致。生物被膜测定结果显示,鼠伤寒沙门菌标准菌株(JS)为中等成膜能力菌株,其cpxR基因缺失株(JSΔcpxR)为弱成膜能力菌株,cpxR缺失后生物被膜形成量明显降低,差异显著(p<0.05);临床分离的鼠伤寒沙门菌中,cpxR基因缺失株SH2ΔcpxR和SH4ΔcpxR与其亲本株(SH2和SH4)相比,生物被膜形成量明显降低,差异显著(p<0.05);cpxR基因缺失株(SH3ΔcpxR和SH7ΔcpxR)与其亲本株SH3和SH7相比,生物被膜形成量显著降低,差异极显著(p<0.01)。结果表明,cpxR基因缺失可使鼠伤寒沙门菌的成膜能力明显降低,该基因在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成过程中发挥着重要作用。

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。

鼠伤寒沙门菌ST1920株cpxR基因缺失株的构建及其对小鼠LD_(50)的影响

为了探索鼠伤寒沙门菌双组分信号系统CpxAR的应答调节蛋白基因cpxR对小鼠半数致死量(LD_(50))的影响,为下一步研究CpxAR系统对鼠伤寒沙门菌致病性的调控机制提供基础。本研究通过ERIC-PCR、MLST分型技术筛选流行克隆株JS_分,应用噬菌体转导技术构建基因缺失突变株JS_分△cpxR,并分别测定了小鼠腹腔注射JS_标、JS_标△cpxR、JS_分、JS_分△cpxR后的LD_(50)。结果显示:89株鼠伤寒沙门菌分为11个ERIC型、4个ST型,流行性克隆株为ST1920型(新的ST型)。LD_(50)结果显示,JS_标、JS_标△cpxR、JS_分、JS_分△cpxR对小鼠的LD_(50)分别为5.79×108、7.85×108、1.91×107、3.35×108 CFU。其中ST1920型代表株(JS_分)的LD_(50)较JS_标低约30.31倍,JS_标△cpxR突变株的LD_(50)比其亲本株JS_标升高了1.36倍,JS_分△cpxR突变株LD_(50)比其亲本株JS_分升高了17.54倍。结果表明cpxR基因缺失株毒力均明显下降,cpxR基因与鼠伤寒沙门菌毒力密切相关,对致病性有重要影响。

鸡源大肠杆菌ΔcpxR的构建及生物学特性研究

在鸡源大肠杆菌临床菌株E41中,构建双组分系统cpxR基因缺失株及回补株,并研究其对相关生物学特性的影响。采用Red同源重组的方法构建cpxR基因缺失株,并通过pBAD/HisA质粒构建回补株。比较临床野生株、缺失株和回补株生长曲线、运动能力、生物被膜形成能力、稳定性、药物敏感性等差异。成功构建缺失株ΔcpxR和回补株CΔcpxR。与野生株E41相比,ΔcpxR缺失株在生长曲线、运动能力及生物被膜形成方面影响不显著。在缺失株稳定性测定中,缺失株在传代15 d后,仍具有良好的稳定性。在药物敏感性测定中,cpxR的缺失导致菌株对链霉素和多西环素的MIC升高2倍,对氟苯尼考的MIC降低至原来的1/2。综上,双组分系统cpxR基因缺失对细菌药物敏感性有明显影响,对其他方面的作用影响不显著,其功能可能被另外的因素代偿性补偿。