肌酸激酶同工酶CK-MB的构建表达、抗体制备及初步鉴定

目的 构建异源二聚体CK-MB重组蛋白并制备其特异性基因工程抗体,以此作为CK-MB定量检测试剂盒的诊断原料,从而辅助临床急性心肌梗死的早期诊断,提高诊断的准确性。方法 通过共表达载体获取异源二聚体CK-MB并进行动物免疫,从而获取小鼠浆细胞;进一步使用单细胞光导系统分离抗原特异性小鼠单个B细胞,并通过单细胞PCR获取抗体轻重链的可变区基因序列后构建基因工程抗体。基于初步的功能验证筛选出候选抗体,并进一步通过棋盘滴定法探究最佳的配对方案,并利用双抗夹心ELISA原理初步组装CK-MB定量检测试剂盒。结果 成功获取CK-MB免疫原;通过单B细胞光导技术筛选出CK-MB抗原特异性小鼠单个浆细胞并制备出2株小鼠源基因工程抗体,且均具有识别天然CK-MB的能力;经由双抗夹心ELISA法筛选出两种配对方案,其拟合曲线的R~2均大于0.99。结论 成功制备出靶向CK-MB的小鼠源基因工程抗体,经由ELISA初步验证抗体的特异性和亲和力,为进一步开发高特异性、高灵敏度的CK-MB新型定量检测试剂盒奠定了坚实基础。

溶血标本的CK-MB活性检测异常结果研究

目的:探讨外周血标本溶血时肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)活性相较于总肌酸激酶(creatine kinase,CK)活性显著升高的内在原因。方法:首先,按照溶血液在不溶血的血浆体积占比为0、0.1%、0.3%、1%、3%比例配制不同溶血程度的标本,使用南京大学医学院附属鼓楼医院常规生化试剂检测其中的CK-MB和总CK活性。随后,再使用该院干化学法、质量法及其它医院实验室的不同检测试剂与方法进行验证。此外,将该院常规化学CK-MB活性检测试剂盒中的不同浓度的CK-M亚单位抑制抗体加入溶血标本中,观察其对总CK活性的影响。最后,再回顾性分析本实验室CK-MB、CK活性检测与溶血指标的相关性。结果:溶血标本中CK-MB活性随溶血现象加剧而升高,最终CK-MB活性显著大于总CK活性。进一步验证比较发现,该现象仅存在于本实验室的常规化学方法中,不存在于干化学法、质量法以及其它公司的CK-MB活性检测方法中。CK-M亚单位抑制抗体对溶血标本的总CK活性无影响。回顾性数据分析结果显示,CK-MB/CK值升高的标本更易发生溶血。结论:溶血可导致CK-MB活性异常增高,此现象与厂家试剂盒中的CK-M亚单位抗体有关。因此,临床实验室须注意溶血对此检测的影响,做好相应的性能验证,并在必要时利用CK-MB质量法进行复查。

人心肌线粒体肌酸激酶的提纯及抗体制备

目的 从人心肌中分离纯化肌小节型线粒体肌酸激酶 (sMtCK) ,制备抗血清 ,从抗血清中制备对sMtCK有特异免疫反应的抗体 ,建立酶联免疫吸附试验 (ELISA) ,测定血清sMtCK。方法 采用超低温高速离心、硫酸铵分级提取、SepharoseCL6B层析等技术分离纯化sMtCK ,免疫新西兰大白兔。应用自制抗sMtCK建立ELISA检测健康体检者、心肌炎及急性心肌梗死 (AMI)患者血清sMtCK。结果 经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和Westernblot鉴定 ,纯化的sMtCK为单一蛋白质条带。制备的抗sMtCK多克隆抗体在琼脂糖免疫扩散实验和ELISA中的抗体效价分别为 1∶32和 1∶80 0。自制抗体建立的ELISA检测心肌炎和AMI患者的血清sMtCK阳性率分别为 5 1.6 % (16 / 31)和 5 4 .1% (2 0 / 37) ,与健康对照组相比差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 经离心、提取、纯化所得的sMtCK是免疫纯。建立的ELISA检测血清sMtCK有助于心肌炎和AMI的诊断。

40例多发性肌炎/皮肌炎病人的临床特点分析

目的提高临床医生对多发性肌炎(PM)/皮肌炎(DM)的正确诊断率。方法对2012年12月至2017年1月期间贵州医科大学附属医院40例PM/DM病人的临床资料进行回顾性分析。结果 40例病人中女性26例,男性14例。临床表现以Heliotrope疹、皮肤瘙痒及乏力多见;实验室检查以血清肌酸激酶升高尤为常见。40例中33例病人行肌电图检查,其中28例(84.85%)出现不同部位的肌源性损害。40例中18例病人行肌肉活检,其中15例(84.00%)显示皮肤/肌肉炎性改变符合"PM/DM"表现。40例病人中12例出现心电图异常,其中9例为窦性心动过速,3例为ST-T改变;16例病人肺部出现间质性肺病(ILD)表现,并以发热、咳嗽、 Gottron征及抗Jo-1抗体阳性、抗核抗体(ANA)阳性较非间质性肺病组(非ILD)多见,并以此分为ILD组和非ILD组。40例病人中确诊有15例病人合并恶性肿瘤,分别为淋巴瘤5例,鼻咽癌3例,宫颈癌和卵巢癌各2例,乳腺癌、肺癌和胸腺瘤各1例。结论 PM/DM以中老年人为发病高峰人群,女性病人更为多见。临床表现以皮疹、瘙痒及乏力最为常见。血清肌酶是诊断PM/DM的重要指标之一。肌电图与皮肤/肌肉活检对PM/DM的诊断具有重要意义。当抗Jo-1抗体阳性、抗核抗体阳性、发热、咳嗽及Gottron征时可作为PM/DM合并间质性肺病的主要预测因素。当病人出现PM/DM且年龄较大时要积极完善相关检查,排除恶性肿瘤合并PM/DM的可能。

人线粒体肌酸激酶广泛型亚型在大肠埃希菌中的表达及抗体制备

目的 获得人线粒体肌酸激酶广泛型亚型 (uMtCK)的全长基因 ,在大肠埃希菌中表达 ,研制抗uMtCK多克隆抗体。方法 采用逆转录PCR从培养的肿瘤细胞 (Hela细胞 )中成功扩增出 10 6 2bp的uMtCK的基因片段 ,插入到质粒pMD18 T中 ,经酶切和测序证实为uMtCK的基因编码序列 ,再插入到质粒pQE30 ,转化大肠埃希菌 ,诱导重组质粒pQE30 uMtCK表达酶融合蛋白。经亲和层析纯化 ,并进行SDS PAGE、westernblot鉴定及酶活性测定。纯化的uMtCK蛋白免疫家兔制备抗uMtCK多抗。结果 RT PCR扩增出的片段经酶切鉴定和测序证实为uMtCK的基因 ;在大肠埃希菌M15中实现了高效、可溶性的融合表达 ,表达量约 17%。重组uMtCK具有CK样催化活性 ,表明原核表达的uMtCK具有类似于天然蛋白质的生物学活性。经免疫印迹分析 ,制备的抗uMtCK多抗适合作uMtCK的进一步分析之用。结论 人uMtCK在大肠埃希菌中实现了高效表达 ,制备了针对uMtCK的抗体。

心肌肌钙蛋白I、抗心肌抗体与小儿心肌损伤的相关研究

目的 探讨心肌肌钙蛋白I(cTn -I)及抗心肌抗体 (AHA)与小儿心肌损伤的关系。方法 对 30例心肌炎 (MC)患儿及 1 8例正常儿童进行血清cTn -I、AHA、磷酸肌酸激酶同工酶 (CK -MB)测定。结果 ①MC组血清cTn -I、AHA、CK -MB的阳性率分别为70 .0 %、36 .7%、2 6 .7% ,均较对照组高 (P <0 .0 1 ) ,cTn -I与CK -MB阳性率比较差异有统计学意义 (P <0 .0 1 ) ;②MC发病病程≤ 1个月cTn -I阳性率较其他时期明显增高 (P <0 .0 5) ,而AHA阳性率较其他时期明显下降 (P <0 .0 1 ) ;③治疗 1 0dcTn -I下降≥ 50 %者及 2 0dcTn -I转阴者 ,临床症状和心律失常等改善明显优于cTn -I下降及转阴缓慢者 (P <0 .0 5)。结论 ①血清cTn -I的检测是判断心肌损伤的敏感指标 ,尤其适用于早期及微小心肌损伤的诊断 ;②血清AHA的检测是心肌损伤的后期诊断及预后判断指标。

血浆CK-MM_3单克隆抗体免疫抑制测定法的建立及其临床应用

人心肌经粗提，离子交换层析，纯化CK-MM抗原。该抗原经杂交瘤技术，制备抗CK-MM单克隆抗体。此抗体特异性抑制血浆CK-MM3。通过免疫抑制法计算抑制活性与CK总活性之比，该比值为心肌梗塞早期诊断指标。此法操作简便、快速、可用于自动分析仪。

新生儿溶血病患儿的实验结果及相关因素分析

目的分析新生儿溶血病(HDN)患儿的实验室检测结果及相关影响因素。方法对369例疑似HDN患儿的新生儿溶血3项和总胆红素、心肌酶等血清学结果,患儿日龄、体重,以及母亲孕周、怀孕次数等相关临床资料进行分析。结果48.24%(178/369)的患儿确诊为ABO血型不合的新生儿溶血病(ABO-HDN);男、女检出率的比较差异无统计学意义(P>0.05);A型与B型血患儿的检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。日龄≤4 d的新生儿检出率(57.92%)明显高于日龄>4 d的患儿(36.53%),差异有统计学意义(P<0.05);体重>3000 g患儿的检出率(52.94%)高于体重≤3000 g患儿(42.42%),差异有统计学意义(P<0.05)。ABO-HDN组的肌酸激酶(CK)和α-羟丁酸脱氢酶(α-HBD)水平高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05);ABO-HDN组与可疑组的总胆红素、CK、乳酸脱氢酶(LD)和α-HBD水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论ABO-HDN检出率与患儿日龄和体重密切相关;早期执行溶血3项检测可以提高ABO-HDN检出率;ABO-HDN患儿可能存在心肌受损,应密切监测。

抗Ro-52抗体阳性的抗合成酶综合征2例报告及文献复习

目的:分析抗Ro-52抗体阳性的抗合成酶综合征(ASS)患者的诊疗过程,总结抗Ro-52抗体与ASS的关系,阐明其临床意义。方法:收集2例抗Ro-52抗体阳性ASS患者的临床资料,分析其临床特征,结合相关文献复习探讨抗Ro-52抗体与ASS的关系。结果: 2例年轻女性患者均因明显的双手关节症状入院,查体可见双手关节肿胀,呈“技工手”样改变,四肢肌力及肌张力正常。肌酸激酶活性升高。均行肌炎抗体谱、肺CT、肌电图和肌肉活检等辅助检查,确诊后给予相关治疗。2例患者肌炎抗体谱均为抗Jo-1抗体和抗Ro-52抗体强阳性,肺CT显示间质性肺疾病(ILD),肌电图提示肌源性损害,肌肉活检均符合特发性炎症性肌病改变。2例患者均明确诊断为ASS,给予糖皮质激素及免疫抑制剂治疗后症状好转,肌酸激酶活性降低,随访至今未见疾病活动及继发肿瘤征象。结论:抗Ro-52抗体作为一种肌炎相关性抗体,可导致ASS患者出现一系列不典型的临床表现,并可能与患者不良预后有关联,应密切随访。

肺炎支原体肺炎患儿外周血CD64及心肌酶与血清MP-IgM抗体滴度的相关性

目的:探讨肺炎支原体肺炎(MPP)患儿外周血CD64、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平与血清MP-IgM抗体滴度的相关性。方法:选取天津市滨海新区塘沽妇产医院儿科收治的130例MPP确诊患儿,按照病情程度分为轻症组(76例)和重症组(54例)。采集患儿外周血测定血清CD64、CK、CK-MB、LDH及MP-IgM抗体滴度。分析不同病情程度患儿的各指标测定结果,分析不同MP-IgM抗体滴度患儿的CD64、CK、CK-MB、LDH水平,并分析CD64、CK、CK-MB、LDH与MP-IgM抗体滴度的相关性。结果:与轻症组相比,重症组患儿的血清CD64指数、CK、CK-MB、LDH水平明显更高(t=13.123、-3.780、-5.807、-7.576,均P<0.05)。重症组中MP-IgM抗体高滴度者占比高于轻症组,低滴度者占比低于轻症组(χ^(2)=58.197,P<0.05)。不同血清MP-IgM抗体滴度患儿的CD64指数、CK、CK-MB、LDH水平比较,均有高滴度组>中滴度组>低滴度组,3组对比差异均有统计学意义(F=8.326、11.744、19.568、35.474,均P<0.05)。相关性分析显示,MPP患儿病情轻重与MP-IgM抗体滴度呈正相关(r=0.556,P=0.000)。CD64指数、CK、CK-MB、LDH均与MP-IgM抗体滴度呈正相关(r=0.521、0.391、0.485、0.598,均P<0.05)。结论:CD64、CK、CK-MB及LDH均与MP-IgM抗体滴度呈正相关,监测4项指标变化对于预测MPP患儿病情变化,指导治疗方案调整有积极作用。

酶联免疫吸附法检测肌酸激酶B亚基含量

1目的 建立酶联免疫吸附法 (EL ISA)检测肌酸激酶 B亚基含量。 2方法 应用脑肌酸激酶抗原制备单克隆抗体 ,采用对酶活力具有激活或抑制的单克隆抗体配对建立 EL ISA法 ,并应用其检测肌酸激酶 B亚基含量。 3结果 肌酸激酶 B亚基含量在 0 .0 5～ 5 0 .0 0 ng间与 A45 0 nm呈半对数直线关系。 4结论 采用建立的 EL ISA法可测定肌酸激酶

成人抗MDA5抗体阳性皮肌炎临床特征

目的分析成人抗黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)抗体阳性皮肌炎(DM)的临床特征,并与抗MDA5抗体阴性DM进行比较。方法收集2021年1月1日至12月31日郑州大学第一附属医院101例成人DM患者资料,根据抗MDA5抗体阳性与否分为抗MDA5抗体阳性(MDA5^(+))组和抗MDA5抗体阴性(MDA5^(-))组,对两组数据进行比较。收集抗MDA5抗体水平定量检测结果,分析其与其他实验室指标的相关性。结果MDA5^(+)组较MDA5^(-)组初诊住院时间长,1 a内住院次数多,发热和咳嗽咳痰症状出现频率较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与MDA5^(-)组相比,MDA5^(+)组红细胞沉降率、涎液化糖链抗原-6(KL-6)、铁蛋白水平升高,中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析显示,抗MDA5抗体水平与D-二聚体、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M水平呈正相关,与肌酸激酶同工酶水平呈负相关(P<0.05)。高分辨率CT显示,MDA5^(+)组肺间质性改变较MDA5^(-)组发生率高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论MDA5^(+)DM较MDA5^(-)DM患者发热、咳嗽咳痰发生率高,肌肉受累较轻,易发生肺间质改变,病情较重,治疗较复杂。KL-6、铁蛋白、抗MDA5抗体水平可作为评估MDA5^(+)DM病情活动的指标。

人脑肌酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定

用事故死亡者脑组织中提纯的人脑肌酸激酶（ＣＫ－ＢＢ）对ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠进行免疫，应用杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞分别与２种骨髓瘤细胞（ＮＳ－１，６５３）融合，筛选得到８株能稳定分泌ＩｇＭ抗体的杂交瘤细胞。对分泌抗体经酶联免疫电泳转移试验（Ｗｅｓｔ－Ｂｌｏｔ）进行了鉴定，其中４种抗体能特异地与ＣＫ－ＢＢ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳带结合。提示这些单克隆抗体有可能应用于肌酸激酶的结构功能研究和临床检验中。

肺炎支原体肺炎患儿CRP与CK-MB水平变化及其临床意义探讨

目的探讨肺炎支原体肺炎(MPP)患儿血清C反应蛋白(CRP)与肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)水平变化及其临床效果。方法回顾探讨2013年10月—2014年12月于该院收治的155例肺炎患儿为主要分析对象,其中MPP组45例患儿中血清肺炎支原体抗体IgM(MP-IgM)结果为阳性;非MP性肺炎组110例:血清MP-IgM阴性;另选取45名体检正常儿童为对照组;对比3组血清CRP与CK-MB水平。结果非MP性肺炎组血清CRP(33.8±12.6)mg/L与MPP组(8.6±6.4)mg/L和对照组(3.1±0.7)mg/L相比较高,而MPP组血清CRP又显著高于对照组,差异有统计学意义(F=905.653,P<0.05);MPP组血清CK-MB(51.2±10.3)IU/L分别较高于对照组(15.9±4.2)IU/L和非MPP性肺炎组(21.7±6.4)IU/L,差异有统计学意义(F=654.544,P<0.05),非MPP性肺炎组血清CK-MB与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论提高肺炎支原体肺炎的诊断依据是肌酸激酶同工酶MB升高,血清C反应蛋白正常或轻微升高,MP-IgM的检测结果为阳性,此外还能对肺炎支原体肺炎患儿的心肌损伤情况做出正确评估,血清C反应蛋白在患儿进行肺炎支原体肺炎的诊断时的意义不大,但MP-IgM阳性且血清C反应蛋白增高对肺炎支原体肺炎的诊断具有提供一定帮助,需及早对患儿进行抗感染治疗。

CK-MB特异性单抗的制备方法及其应用

本研究拟建立肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)特异性单克隆抗体(m Ab)的研制方法,对抗CK-MB单抗进行评价分类及性质鉴定,并初步建立CK-MB定量检测试剂。以CK-MB抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规单抗制备技术,使用间接和捕获ELISA差异筛选法筛选单抗。利用肌酸激酶同工酶(CK-MM/BB/MB)抗原对所制备单抗的抗原识别表位进行鉴定,另通过免疫印迹法及合成CK-MM、CK-BB差异性的线性表位肽鉴定对所制备的单抗进行评价分类。使用双抗体夹心ELISA方法筛选检测CK-MB抗原的配对m Ab,并初步建立CK-MB定量检测试剂。使用74例临床标本初步评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性。最终,我们成功筛选到22株稳定分泌抗CK-MB抗体的杂交瘤细胞株,这些单抗可以分为线性、偏构象的CK-MB和CK-MM或者CK-BB交叉的单抗以及与CK-MB特异反应的偏构象型单抗,并使用偏构象型单抗研制出CK-MB定量检测试剂,该试剂与罗氏试剂相关系数r达到0.930 9。综上所述,本研究建立了研制CK-MB偏构象型特异性单抗的筛选方法,通过对所筛选的单抗进行分析鉴定并建立了CK-MB定量检测试剂,与罗氏试剂检测结果符合率高。

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)单克隆抗体制备及检测方法的建立

该文通过制备出特异性高的单克隆抗体,初步建立了双抗夹心ELISA定量测定CK-MB的方法,为CK-MB试剂和原料的国产化奠定重要的基础。以购入的CK-MB抗原为免疫原,对随机选取的5只6~8周龄Balb/c健康雌性小鼠进行免疫。采用有限稀释法、间接ELISA、捕获ELISA方法,最终筛选出了3株能够稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为2F6、2H3和2H9,其分泌的单克隆抗体亚型均为IgG3,腹水效价分别为1:102000、1:51200和1:102000。采用亲和层析法对3株杂交瘤细胞产生的小鼠腹水进行纯化,分光光度计测定纯化后的单克隆抗体2H3、2F6、2H9的浓度分别为5 mg/mL、6 mg/mL、6 mg/mL,SDS-PAGE结果表明,成功纯化了小鼠腹水,能够清晰地观察到轻链和重链两条带。Western blot结果表明,单克隆抗体2F6、2H3和2H9均能特异性识别CK-MB蛋白。间接ELISA及捕获ELISA方法检测显示,单克隆抗体2H3只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2H9只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2F6只与CK-MB及CK-MM发生捕获ELISA方法反应。稳定性实验表明,3株杂交瘤细胞都能稳定分泌抗CK-MB单克隆抗体。高质量单克隆抗体的获得,为建立CK-MB检测方法奠定了基础。