噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crtB,编码八氢番茄红素合成酶。利用PCR技术扩增出crtB基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtB。重组质粒转化大肠杆菌,构建工程菌株。经IPTG诱导,工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成酶,表达量占菌体总蛋白的40%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex 75凝胶层析柱纯化,得到了电泳纯的重组八氢番茄红素合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为35 kDa,pI值为7.3。

种子特异性表达噬夏孢欧文氏菌crtB基因的植物表达载体构建

利用PCR技术扩增出tp和crtB基因,胶回收后分别连接到pMD18-T载体测序。tp和crtB基因经酶切回收后通过pBlue-scriptKS质粒连在一起构建成pSK-tp-crtB,通过BamHⅠ和SacⅠ酶切,从pSK-tp-crtB载体上切下目的基因片段tp-crtB,替换pBI121-napA载体中的GFP基因,构建了tp-crtB基因在植物种子中特异性表达的载体pBI121-tp-crtB。转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。测序鉴定后将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105,经菌液和质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-tp-crtB,为crtB基因功能的进一步研究奠定基础。

采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥

利用农杆菌花序浸染法将构建的植物表达载体pBI121-tp-crtB转入拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Columbia中,共获得了14株转基因系,并进行了转基因拟南芥种子萌发实验。结果表明tp-crtB基因已经成功转入拟南芥中,其不影响拟南芥种子的正常萌发。