转cry1Ac1基因抗虫水稻和非转基因亲本的主要营养成分比较

秀水134-Bt是以秀水134为受体材料,通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法导入抗虫基因cry1Ac1获得的转基因纯合品系。对转cry1Ac1抗虫基因水稻秀水134-Bt与其原亲本秀水134稻米的关键营养成分进行比较分析,包括对水分、脂肪、粗灰分、粗蛋白、氨基酸、脂肪酸、矿物质和维生素的测定分析等。结果表明,转基因水稻秀水134-Bt与非转基因亲本秀水134非常相似,在关键性营养成分上差异不明显。表明在水稻遗传转化操作过程中,T-DNA插入并未明显改变原亲本的上述品质性状。

转cry1Ac1基因抗虫水稻的培育

本研究以粳稻＂秀水134＂为受体材料,通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法导入抗虫基因cry1Ac1,获得12个独立转基因株系。经过PCR确认转基因植株均为cry1Ac1阳性植株。半定量RT-PCR实验表明,目的基因在所有转化体中都能够表达。用荧光定量PCR分析拷贝数,结果表明有3个转化体携带单拷贝目的基因。通过TAIL-PCR方法对单拷贝转化体基因插入位点分析,发现其中一个转化体的目的基因插入到基因间区,位于第2染色体Os02G0539500（Chr.2：20858661~20860159）基因上游约2.4 kb处,未对受体材料的已知功能基因造成破坏。通过此单拷贝转化体自交后,从后代群体中获得纯系并进行田间农艺性状及抗虫性调查,结果显示此纯系抗虫效果佳,并且没有造成主要农艺性状的明显改变。研究结果表明,我们已经获得cry1Ac1基因在水稻植株中可以稳定表达,并且主要农艺性状没有明显改变的高抗虫水稻转基因材料。

大肠杆菌中利用苏云金芽胞杆菌强启动子p1Ac指导Cry1Ac蛋白表达的特性分析

对利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)强启动子——cry1Ac基因启动子p1Ac指导cry基因在大肠杆菌中的表达进行了研究。结果显示,大肠杆菌中由启动子p1Ac指导表达的Cry1Ac蛋白与苏云金芽胞杆菌来源的Cry1Ac蛋白在碱溶性、胰蛋白酶活化、杀虫活性等方面有较好的一致性,从而解决了目前商业化载体大肠杆菌表达cry基因时形成不易溶解的包涵体问题。同时,还对p1Ac指导的cry1Ac基因在大肠杆菌中表达的发酵条件进行了初步探索。

南繁条件下转基因水稻对根际土壤微生物的影响

【背景】随着转基因技术的发展,转基因作物的安全评价已经成为目前的研究热点。海南省南部三亚、乐东、陵水等地形成的南繁育种区是我国的"种业硅谷",其天然气候与环境优势,为加速世代繁殖、缩短育种年限提供了条件。大量的育种材料汇集于南繁区域,在利用南繁优势的同时,也造成了潜在的生态风险,因而在南繁区开展转基因生物安全评价研究具有重要的意义。【方法】采用平板培养计数和分子鉴定手段,对海南三亚南繁区种植的转cry1 Ab/cry1 Ac基因水稻TT51及其对照常规水稻明恢63(MH63)的根际土壤微生物进行了监测。【结果】连续3个种植周期(42个采样时间点)的监测发现,TT51与MH63根际土壤微生物数量变化趋势基本一致,说明转基因水稻未对根际土壤微生物数量变化趋势造成明显影响。TT51与MH63根际土壤细菌类群主要种属组成一致。【结论与意义】种植转cry1 Ab/cry1 Ac基因水稻TT51不会对根际土壤微生物数量和种类组成造成明显影响。本研究可为在我国南繁育种区开展转基因水稻安全评价提供数据支持。

不同启动子表达Cry1Ie蛋白的特性分析

苏云金芽胞杆菌启动子P1Ac与T7启动子表达的Cry1Ie蛋白对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫的杀虫活性有较大差异。P1Ac启动子表达的Cry1Ie蛋白LC50为1.73μg/mL,T7启动子表达的Cry1Ie蛋白LC50为18.18μg/mL,后者是前者的10.5倍。主要从形态、碱溶性及抗胰蛋白酶稳定性等方面对其进行了初步的探索。结果显示,两者在形态上无显著差异,均有相对较为规则的颗粒存在;在碱溶性方面无显著差异,均有约20.0%的包涵体能溶解于pH10.5 50.0 mmol/L Na2CO3的溶液;在对抗胰蛋白酶的稳定性方面无明显差异,由此说明这三方面都不是二者活性差异的原因,推测是T7启动子表达的Cry1Ie蛋白折叠不正确导致其活性较差。

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法

针对转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)TT51-1及其回交后代中外源基因的检测建立了一种三引物多重PCR检测方法。结果表明,三引物PCR体系可以准确区分cry1Ab/cry1Ac基因纯合、杂合和阴性三种基因型,纯合体中只扩增出一条298 bp片段,阴性材料中只扩增出一条787 bp片段,杂合体中同时扩增出298 bp片段和787 bp片段。该体系的建立为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。

基于质谱检测转基因生物外源蛋白质的消化稳定性

基于无标记定量质谱检测技术建立了一种新的转基因生物外源蛋白质消化稳定性评价方法。以牛β-乳球蛋白、牛血清白蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂为标准蛋白质,经模拟人体胃/肠消化液消化后进行凝胶电泳分离,切取目标蛋白质条带进行酶切,提取肽段进行纳升液相色谱-电喷雾串联质谱分析。基于Mascot数据库检索鉴定目标蛋白质。计算各消化时间点蛋白质匹配肽段数与消化前蛋白质匹配肽段数的比值,当比值≤0.50时判断为目标蛋白质在该时间段内已消化。将此方法应用于转基因抗虫水稻"华恢1号"外源蛋白Cry1Ab/1Ac的消化稳定性分析,结果显示在模拟胃液中消化2 min时,比值下降到0.50以下,在模拟肠液中消化15 s后比值下降到0.50以下,表明该蛋白在胃/肠消化液中具有消化不稳定性。

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM0304叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。

转基因抗虫玉米转育株Bt蛋白的表达特性分析

为了对转基因抗虫玉米转育株Bt蛋白的表达特性进行分析,用Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒定量检测了3种含Bt基因的玉米回交后代品系BC1F1(HZ3152、HZ3342、HC0142)在相同生长时期不同组织和不同生长时期相同组织中Bt蛋白的表达量。结果表明,在乳熟期BC1F1不同组织中Bt蛋白表达含量的高低顺序为:叶片>胚乳>花丝>种子苞叶;在BC1F1不同的生长发育阶段(苗期、抽丝期和乳熟期),叶片中Bt蛋白的含量随生育期的推移呈明显先上升后下降趋势,Bt蛋白含量在抽丝期达到最大,之后又开始下降;苗期(HC0142、HZ3152、HZ3342)Bt蛋白的含量(4.16、3.75和3.72μg·g-1)和乳熟期(5.56、4.58和4.79μg·g-1)的含量分别是抽丝期(6.05、5.36和5.50μg·g-1)的68%、69%、67%和91%、85%、87%。一般在玉米生长后期Bt蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。该研究表明Bt蛋白在玉米回交后代中可以稳定表达,对Bt的相关研究为转基因育种等提供了参考依据。

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响

【目的】为探究转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响。【方法】以转Cry1Ac/1Ab基因棉与其亲本常规棉为实验材料,利用取食不同棉花品种叶片的棉铃虫饲喂异色瓢虫幼虫。【结果】与常规亲本棉相比,取食饲喂转基因棉花叶片的初孵棉铃虫幼虫的异色瓢虫幼虫从1龄发育至化蛹期时间延长0.77 d,但差异不显著;除1龄幼虫体重增加(0.0773 mg)外,其余各龄期幼虫体重均有所下降,但差异均不显著;异色瓢虫1、2、3、4龄幼虫对初孵棉铃虫捕食量均随棉铃虫密度的增加而增加,捕食功能反应均符合HollingⅡ圆盘方程。【结论】转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育无显著影响,饲喂取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花的棉铃虫对异色瓢虫捕食功能无显著差异。

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对田间稻纵卷叶螟和二化螟及其捕食性天敌的影响

为研究转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和二化螟Chilo suppressalis及其捕食性天敌的影响,采用剥查法和吸虫法,于2012—2013年在江西省南昌县调查了赣绿1号田间稻纵卷叶螟与二化螟的发生为害情况及其捕食性天敌拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata和拟水狼蛛Pirata subpiraricus的种群动态。结果表明,与非转基因亲本9311水稻相比,在2012和2013年螟虫为害高峰期,赣绿1号田间稻纵卷叶螟百株虫量分别减少57.78头和27.78头,卷叶率分别降低20.46%和6.50%;二化螟百株虫量分别减少24.44头和152.22头,枯心/白穗率分别降低13.02%和14.20%。此外,赣绿1号与9311水稻田间拟环纹豹蛛和拟水狼蛛的种群动态趋势基本一致。研究表明,转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号能有效控制稻纵卷叶螟和二化螟,而对其捕食性天敌拟环纹豹蛛和拟水狼蛛无显著影响。

转基因水稻表达的Bt蛋白对拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）体内保护酶活性的影响

把取食24h的转Cry1Ab／Cry1Ac基因水稻叶片的稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）幼虫，分别喂养拟环纹豹蛛3天、6天、9天、12天后，采用酶活力测定方法探究了转基因水稻表达的Bt蛋白对拟环纹豹蛛体内3种保护酶（SOD、POD和CAT）活性的影响。结果表明：就整体来看，实验期间处理组蜘蛛体内3种保护酶（SOD、POD和CAT）的活性均受到Bt蛋白的影响，且前期3种保护酶活性均表现不同程度的被抑制，明显低于对照组。在实验过程中，SOD活性随着处理时间的增加而逐渐增强，至处理第9天时达到最大值；同时处理组POD、CAT活性也随着处理时间的增加而增强，实验初期（前6天）均显著低于对照组，而至第9天则均高于对照组。由此可见，Bt基因在水稻体内所表达的Bt蛋白能够沿食物链传递至次级消费者，并且在一定程度上对次级消费者产生影响。

多年种植Bt稻后外源蛋白在土壤中的积累

外源蛋白在环境中的残留与积累是转Bt基因作物环境安全评价的重要内容之一。我国已育成多个具有商业化前景的Bt稻品系,但目前多年种植Bt稻后Bt外源蛋白是否会在土壤中积累还不清楚。本研究在同一试验田连续9年种植了转cry1Ab/1Ac基因明恢63(华恢1号)和转cry2A基因明恢63水稻,采用酶联免疫吸附法(ELISA)跟踪监测了分蘖期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量变化,试验第1年(2012年)和最后1年(2020年)还测定了苗期、开花期和成熟期根际土中外源蛋白含量。结果表明:2012年,转cry1Ab/1Ac基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为1.25、1.77、1.97、1.71和0.30 ng·g^(-1),2020年分别为1.30、1.69、2.03、1.77和0.43 ng·g^(-1);2012年,转cry2A基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为0.91、1.52、1.53、1.37和0.12 ng·g^(-1),2020年分别为0.95、1.43、1.61、1.40和0.15 ng·g^(-1)。多因素方差分析显示,时间效应对Bt外源蛋白积累不显著,而品种和生育期效应显著。Bt稻生长过程中根际土中可以检测出微量的Bt外源蛋白,但收获后60 d已经基本降解完毕,根际土中Bt外源蛋白含量不会随着种植时间的增加而累积。

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫的控制效果及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾生长发育的影响

为评估转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性及对非靶标害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾S.litura生长发育的影响,采用室内生测法测定其对棉铃虫的抗性及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾不同龄期幼虫存活率、营养代谢及中肠酶活性的影响。结果表明,转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫第2代幼虫的抗性程度最高,幼虫校正死亡率达91.33%,但对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性程度较低,幼虫校正死亡率分别为15.33%和13.33%。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾各龄期幼虫取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,其存活率与取食常规棉花对照无显著差异;甜菜夜蛾对转Cry1Ac/1Ab基因棉花叶片的相对取食量、近似消化率分别为16.68和93.12%,均高于取食常规棉花对照的10.72和92.00%,但差异不显著,而斜纹夜蛾取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后的各项营养指标均低于取食常规棉花对照,差异也不显著。取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,甜菜夜蛾的过氧化物酶活性为0.02 U/mg prot,显著低于取食常规棉花的0.05 U/mg prot;斜纹夜蛾的酸性磷酸酶活性为0.15 U/mg prot,高于取食常规棉花的0.10 U/mg prot,但差异不显著,其它中肠酶活性均低于对照,亦无显著差异。