苏云金杆菌cry1Ib基因的克隆、表达与活性研究

根据cry1Ib类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)GS8菌株的质粒DNA为模板扩增出片段长为2.16kb的cry1Ib全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-21b,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,诱导表达出81.20kD的蛋白。推导的分子量为81.20kD,生物信息学分析表明其由719个氨基酸组成,氨基酸序列与Cry1Ib1蛋白的相似性为99.58%,不同于已知的10种Cry1Ib蛋白,是一种新的Cry1Ib蛋白,其基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ib3。杀虫活性测定结果表明:Cry1Ib3对小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50为0.076 3μg/mL,而对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、家蚕(Bombyx mori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和榆兰叶甲(Pyrrhalta aenescens)基本上没有活性。该基因的获得为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源,亦为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了重要依据。

苏云金芽胞杆菌cry1Ib2基因的克隆与生物信息学分析

BRC-ZLL4是一株从鱼尾葵(Cargota mitis Lour)上分离到的,对柑橘凤蝶幼虫具有毒性的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株。本试验采用PCR-RFLP技术鉴定该菌株中含有cry1Ib基因。设计一对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点,以BRC-ZLL4的总DNA为模板,扩增cry1Ib全长基因。生物信息学分析表明,该基因全长2160bp,编码一个由719个氨基酸组成的、相对分子质量为81.39ku、等电点为6.425的蛋白。该基因已在GenBank上登录(登录号为EU233027),并被Btδ-内毒素国际命名委员会正式命名为cry1Ib2。信号肽预测显示,Cry1Ib2蛋白没有信号肽,为胞内蛋白。二级结构预测显示,在Cry1Ib2蛋白二级结构中,25%为α-螺旋,28%为β-片层,18%为β-转角,29%为无规则线圈。此外还对Cry1Ib蛋白的功能区和三级结构进行了预测和分析。

苏云金芽胞杆菌cry1Ib6基因的克隆、表达及活性的研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)能产生杀虫晶体蛋白(Insecticida Crystal Proteins,ICPs),对敏感昆虫有强烈毒性,而对高等动物和人无毒性。ICPs由cry或cyt基因编码,根据cry1I型基因设计引物,以Bt LB52菌株的质粒DNA为模板,扩增出了全长为2.1 kb的cry1I基因,其能通过表达载体pEB在大肠杆菌中高效表达为79.9 kDa的蛋白。经过AlginX软件分析该蛋白由712个氨基酸组成,分子量为79.9 kDa,等电点为6.54,为弱酸性蛋白质,NCBI Blast比对该蛋白的氨基酸序列与Cry1Ib3的相似性最高为98%,有12个氨基酸的差异。该基因已在GenBank中注册,登录号为ADK38579,并被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ib6。它的表达产物对小菜蛾具有较高的毒力,LC50为1.196μg/mL,为抗虫转基因植物研究提供了新的基因。