柱花草SgPAL3基因启动子的克隆及上游转录因子的筛选

柱花草(Stylosanthes spp.)是热带地区广泛种植的重要草种,炭疽病是危害柱花草的严重病害,柱花草SgPAL3基因具有抗炭疽菌的功能。本研究对启动子区域-2 000~0 bp,-1 500~0 bp序列分别构建诱饵载体并检测自激活,结果表明500 ng·mL^(-1)金担子素(Aureobasidin A,AbA)可以抑制两种诱饵载体的自激活。利用Gateway技术构建了柱花草响应炭疽菌的酵母cDNA文库,其容量为1.20×107,插入片段主要分布在750~2 000 bp,重组率为100%;利用酵母单杂交技术,筛选与SgPAL3基因启动子互作的转录因子,并验证了3个转录因子(SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8)与SgPAL3启动子的互作关系;qRT-PCR分析表明,SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8均响应炭疽菌的侵染,说明它们可能调控柱花草对炭疽病的抗性。本研究为进一步解析SgPAL3响应炭疽菌侵染的转录调控机制奠定了基础。

miR-23a/27a/24基因簇g.65307469G>A突变对大白猪产仔数和启动子活性的影响

[目的]本文旨在研究大白猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点多态性与产仔数性状的关系及潜在机制,为母猪繁殖性状的分子育种提供新的潜在遗传标记。[方法]利用混池测序技术筛选猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点,直接测序法对大白猪群体(n=345)miR-23a/27a/24基因簇突变位点进行基因分型,计算遗传多样性;用线性模型对突变位点多态性与产仔数性状进行关联性分析;构建不同等位基因类型启动子载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过检测荧光素酶活性分析突变对启动子活性的影响;用生物信息学方法预测不同等位基因类型启动子潜在结合的差异转录因子,用荧光素酶活性分析差异转录因子对不同等位基因类型启动子活性的影响。[结果]在猪miR-23a/27a/24基因簇启动子-648 nt(Chr.2,65307469 nt)处发现1个新的G/A突变,命名为g.65307469G>A。在大白猪群体中发现3种基因型(GG、GA和AA),其中GG为优势基因型(89.57%),G等位基因为优势等位基因(94.64%)。关联性分析发现,GA基因型母猪的总产仔数(TNB)比GG基因型母猪每胎高0.56头(P<0.05)。荧光素酶活性分析结果显示G等位基因类型启动子活性显著高于A等位基因类型(P<0.05)。在不同等位基因类型启动子间发现1个潜在结合的差异转录因子死亡相关蛋白1(THAP1),成功构建猪THAP1基因过表达载体,共转试验结果显示转录因子THAP1对不同等位基因类型启动子活性均无显著影响(P>0.05)。[结论]miR-23a、miR-27a和miR-24是大白猪产仔数性状的候选基因,g.65307469G>A突变抑制miR-23a/27a/24基因簇的启动子活性,但与转录因子THAP1无关。

线粒体解偶联蛋白2基因多态性及启动子区域基因型与糖尿病肾病发病的关系

目的观察线粒体解偶联蛋白2(UCP2)基因多态性,分析UCP2基因启动子区域基因型与糖尿病肾病(DKD)发病的关系。方法2型糖尿病(T2DM)患者180例,根据尿白蛋白/肌酐比值(ACR)和预估肾小球滤过率(eGFR)分为DKD患者92例[糖尿病肾病组,ACR≥30 mg/g、eGFR<60 mL/(min·1.73 m^(2))]和单纯糖尿病患者88例[单纯组,ACR<30 mg/g、eGFR≥60 mL/(min·1.73 m^(2))],采用多重聚合酶链反应进行UCP2基因测序,另利用二元Logistic回归分析UCP2基因启动子区域位点-866G/A三种基因型(A/A、G/A、G/G)与DKD的关系。结果糖尿病肾病组-866G/A位点G/G基因型频率为33.0%、G/A基因型频率为40.9%、A/A基因型频率为26.1%,单纯糖尿病组分别为30.4%、56.5%、13.0%,两组A/A基因型频率比较,P均<0.05;糖尿病肾病组Ala55Val位点C/C基因型频率为31.8%、C/T基因型频率为42.0%、T/T基因型频率为26.1%,单纯糖尿病组分别为28.3%、57.6%、14.1%,两组比较,P均>0.05;糖尿病肾病组45bp INS/DEL位点DEL/DEL基因型频率为73.9%、DEL/INS基因型频率为23.9%、INS/INS基因型频率为2.3%,单纯糖尿病组分别为84.8%、13.0%、2.2%,两组比较,P均>0.05。在-866G/A隐性模型中,A/A基因型是DKD发生的风险因素,相比于G/A和G/G,A/A基因型发生DKD的风险增高2.359倍[2.359(1.091~5.099),P=0.029];当矫正性别、年龄后,A/A基因型发生DKD的风险增高2.491倍[2.491(1.142~5.437),P=0.022];当进一步矫正性别、年龄、糖尿病病程、糖化血红蛋白、尿酸、总胆固醇后,A/A基因型发生DKD的风险增高2.491倍[2.489(1.004~6.172),P=0.049]。在-866G/A显性模型中,相比于G/G基因型,G/A和A/A基因型发生DKD的风险无统计学差异。结论UCP2基因启动子区域存在3个位点的基因多态性,包括-866G/A、Ala55Val以及45bp插入缺失突变,其中-866G/A与DKD的发生密切相关,A/A基因型患者发生DKD的风险高于G/A、G/G基因型。

CD14基因启动子区-159C/T多态性在H型高血压患者中的分布

目的:调查H型高血压患者中CD14基因启动子区-159C/T基因多态性分布情况。方法:用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术对H型高血压组、普通高血压组和对照组的CD14基因启动子区-159C/T多态性分布进行研究,同时检测血清同型半胱氨酸(HCY)及其他生化指标。结果:H型高血压组CC型、CT型、TT型分布频率分别为10%、43%、47%,C和T等位基因频率分别为31.5%、68.5%;普通高血压组CC型、CT型、TT型分布频率分别为10%、50%、40%,C和T等位基因频率分别为35%、65%;对照组CC型、CT型、TT型分布频率分别为13%、53%、34%,C和T等位基因频率分别为39.5%、60.5%,三组基因分型和等位基因频率均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,H型高血压组、普通高血压组高密度脂蛋白(HDL-C)水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:H型高血压患者CD14基因启动子区-159C/T多态性分布无明显差异。

BDNF与5-HTT基因启动子区多态性的交互作用对精神分裂症暴力攻击行为的影响

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)与5-羟色胺转运体基因启动子区多态性(5-HTTLPR)的交互作用对精神分裂症暴力攻击行为(SCZ-AB)的影响。方法选取169例精神分裂症患者,根据是否有暴力攻击行为分为A组(有暴力攻击行为,n=87)与B组(无暴力攻击行为,n=82)。比较两组一般资料、BDNF与5-HTTLPR基因分型及等位基因频率分布、A组BDNF与5-HTTLPR基因型间Buss&Perry攻击量表和Barratt冲动量表评分,Logistic回归分析不同BDNF基因型和5-HTTLPR基因型对SCZ-AB的影响。运用MDR统计分析不同基因型间交互作用。结果A组与B组间Val和Met频率比较,差异有统计学意义(P<0.05),A组Val/Val频率低于B组(P<0.05),Val/Met和Met/Met基因型频率高于B组(P<0.05);Buss&Perry攻击量表和Barratt冲动量表比较发现:A组Met/Met基因型的各项分值均高于Val/Val、Val/Met基因型(P<0.05);控制性别因素,携带Met等位基因有暴力攻击行为的精神分裂患者的相对危险度是不携带Met等位基因患者的2倍(P<0.05)。Buss&Perry攻击量表和Barratt冲动量表比较发现:L/L基因型患者的各项分值均显著高于S/S基因型(P<0.05)。同时携带Met和L等位基因者的相对危险度是不携带Met和L等位基因者的2倍(P<0.05)。结论同时携带BDNF Met和5-HTTLPR L等位基因患者有暴力攻击行为的危险度较高,BDNF Met等位基因发挥主要作用,Met/Met基因型患者病情更严重。

毛竹PheMADS47a基因启动子克隆及功能分析

MADS-box转录因子家族成员SVP作为开花调控网络的中枢调控因子,也可在植物芽发育中发挥作用并参与逆境及激素途径。为探究毛竹(Phyllostachys edulis)PheMADS47a基因启动子的功能,本研究克隆了PheMADS47a约2000 bp的启动子序列,构建了不同长度5′端缺失启动子(P1:1949 bp、P2:825 bp、P3:578 bp、P4:493 bp、P5:230 bp、P6:79 bp)的植物表达载体(含报告基因GUS),遗传转化至拟南芥(Arabidopsis thaliana),通过β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色分析其活性。结果显示,PheMADS47a基因启动子中存在脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)等激素应答元件及低温、干旱等非生物胁迫响应元件以及众多光响应元件。在10和15 d幼苗期,除P4启动子外,其他长度的启动子片段均有活性;在23和33 d苗期,P1~P3启动子活性强。全长启动子P1驱动的GUS基因在拟南芥的根、茎、叶、花序、角果基部均有表达,而在角果和侧枝中无表达。PheMADS47a基因启动子活性明显受MeJA、SA促进,不同长度的启动子活性对ABA、GA和IAA的应答不同。不同长度的启动子活性均可被黑暗、干旱、NaCl、4℃低温抑制。推测-578~-493 bp是该启动子活性的关键区域,该启动子是MeJA诱导型启动子。本研究为应用PheMADS47a基因启动子和探究该基因的调控机制提供了理论依据。

工业大麻腺毛发育基因CsMIXTA启动子克隆及功能分析

CsMIXTA在调控大麻雌性花器官中腺毛的发生和发育中发挥重要作用。为了研究CsMIXTA基因的表达调控,对CsMIXTA基因上游2199 bp启动子序列进行了克隆。通过PlantCARE预测发现,该启动子序列具有多个胁迫响应元件与光响应元件。根据预测的响应元件分布情况,扩增获得5个5′端缺失的启动子片段。用克隆的启动子全长和缺失片段分别构建融合GUS基因的表达载体,并将其瞬时转化到烟草叶片和工业大麻糖叶中。通过GUS染色观察发现,CsMIXTA启动子的核心区域位于–393~–99 bp之间,包含赤霉素响应元件TATC-box和转录起始元件TATA-box。通过LUC荧光素酶表达发现,CsMIXTA启动子的核心区域具有转录活性。研究还发现,CsMIXTA基因在工业大麻糖叶的腺毛中特异性表达。对启动子进行胁迫响应分析的结果显示,低温、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)都能增强该启动子的活性。这些结果为CsMIXTA基因调控机制研究奠定了重要基础。

牛TARDBP基因核心启动子鉴定与转录调控分析

【目的】为了解牛TARDBP基因结构、功能及启动子活性区域,分析该基因的转录调控机制。【方法】通过PCR技术克隆牛TARDBP基因编码区全长序列。应用生物信息学软件对牛TARDBP蛋白性质和结构进行分析。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测TARDBP基因在泌乳期荷斯坦奶牛不同组织中的表达情况。应用5'RACE技术确定牛TARDBP基因的转录起始位点,PCR技术克隆牛TARDBP基因启动子区和5'端系列缺失片段,并运用生物信息学软件对牛TARDBP基因启动子区域CpG岛和潜在转录因子结合位点进行预测,双荧光素酶报告系统确定该基因的核心启动子区域。【结果】牛TARDBP基因在包括乳腺在内的多个组织中均有表达。TARDBP蛋白是一种水溶性非分泌蛋白,存在RNA识别结构域和DNA结合位点。TARDBP基因启动子区存在2个CpG岛和大量转录因子结合位点包括SP1、PPARA、PPARD、PPARG、SREBF1等。双荧光素酶活性分析结果显示牛TARDBP的核心启动子区位于-476--149之间,该区域包含Sp1、PPARG、PPARD、SREBF1结合元件,但不存在TATA-box。【结论】牛TARDBP基因在奶牛多个组织中均有表达。-476--149片段为牛TARDBP基因的核心启动子区,且该区域中存在与乳脂合成和分泌相关的转录因子结合位点。

山羊NPC1基因核心启动子鉴定与转录调控分析

NPC1基因编码的C型尼曼匹克蛋白1(NPC1)参与脂筏形成、病原微生物内吞以及内吞体的胞内转运等过程。本试验旨在阐明海南黑山羊NPC1基因的转录调控机制,为研究病原微生物与宿主细胞互作提供理论参考。首先,以山羊NPC1基因1466 bp启动子序列为模板,构建9个启动子5'端连续缺失的双荧光素酶报告载体,筛选NPC1基因核心启动子区;继而对核心启动子区的关键转录因子进行预测分析,构建转录因子结合位点缺失的双荧光素酶报告载体,筛选NPC1基因的关键转录因子结合位点。结果表明:山羊NPC1基因的核心启动子区位于转录起始位点上游-195 bp至-60 bp,并且该区域存在E2F3(-134/-120 bp)、SREBP-1(-107/-96 bp)、SP1(-68/-62 bp)等多个转录因子结合位点。双荧光素酶报告实验结果表明,缺失E2F3、SREBP-1、SP1三个转录因子结合位点均会使山羊NPC1基因启动子的转录活性显著下降(P<0.01),且缺失SREBP-1结合位点后NPC1基因转录活性下降最显著。提示,SREBP-1转录因子对海南黑山羊NPC1基因转录活性具有重要的调控作用。本试验成功鉴定山羊NPC1基因的核心启动子区(-195/-60 bp)及该区域的关键转录因子结合位点SREBP-1,为进一步研究山羊NPC1基因介导病原微生物与宿主互作分子机制提供理论基础。

葡萄VvAGL12基因启动子克隆及表达活性分析

MADS-box家族是植物最大的转录因子家族之一,在参与逆境胁迫与调控开花应答中具有重要作用,其AGL12-like亚组在葡萄中的功能尚不清楚。从黑比诺葡萄基因组克隆获得VvAGL12启动子(proVvAGL12),对启动子序列元件进行分析,发现该启动子区域存在多种与逆境胁迫相关的顺式作用元件。构建proVvAGL12驱动的GUS表达载体,并在拟南芥和烟草中进行转化,发现proVvAGL12启动子片段在拟南芥中具有启动活性,其驱动GUS在转基因拟南芥植株的叶片、茎段、花器官、根、果荚部位表达,表达活性可持续整个生长周期。转基因拟南芥和烟草胁迫处理实验表明,proVvAGL12驱动的GUS活性受赤霉素、脱落酸、聚乙二醇和低温调控。

葡萄VvCCD1b基因克隆及与其启动子互作的转录因子筛选

【目的】筛选葡萄类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)基因VvCCD1b启动子互作的转录因子,挖掘参与调控葡萄类胡萝卜素代谢的潜在因子,为深入探究葡萄类胡萝卜素的代谢调控网络提供理论参考。【方法】克隆VvCCD1b基因的cDNA及其启动子序列,利用生物信息学软件对VvCCD1b基因的染色体位置、启动子顺式作用元件及其编码蛋白的理化性质、保守结构域等进行预测分析。基于转录组数据分析不同葡萄品种及不同处理下葡萄CCD家族成员表达模式。通过酵母单杂交技术筛选与VvCCD1b基因启动子互作的转录因子,并进行点对点验证。【结果】通过PCR克隆获得VvCCD1b基因序列全长1641 bp,位于13号染色体上,编码546个氨基酸残基,为亲水性蛋白,二级结构由α-螺旋(16.67%)、β-折叠(5.49%)、延伸链(24.54%)和无规则卷曲(53.30%)构成,具有RPE65保守结构域。VvCCD1b基因启动子含有光响应元件(G-box、3-AF1 binding site、GATA-motif、TCT-motif)、水杨酸(SA)响应元件(SARE)、脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)及AP2/ERF、WRKY、MADS-box转录因子结合元件。VvCCD1b基因表达水平随果实发育逐渐升高且受光照与逆境胁迫的影响。以VvCCD1b基因启动子为诱饵,初步筛选出VvRAP2-4、VvWRKY4、VvBHLH137转录因子及葡萄液泡加工酶、葡萄糖苷酶等18个功能蛋白,其中VvRAP2-4、VvWRKY4转录因子与VvCCD1b基因启动子间存在互作。【结论】VvCCD1b为亲水性蛋白,基因表达水平随果实发育逐渐升高,且受到干旱、高温、水涝胁迫和光照的影响。通过酵母单杂交技术筛选出与VvCCD1b启动子互作的候选转录因子。

水稻OsTLP12基因启动子GUS表达载体的构建与转化

植物中类甜蛋白TLPs不仅参与宿主抵御真菌入侵的过程,还参与植物对非生物胁迫的防御。本试验采用PCR技术从籼稻特青中克隆了OsTLP12基因上游2000 bp的启动子片段,并分析了其中所含的顺式作用元件。随后,构建了与GUS报告基因融合的表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法将融合表达载体导入水稻中,随后进行了转化植株的筛选,并对转基因植株进行了GUS染色分析。本研究得到以下结果:1) 成功克隆了水稻中OsTLP12基因的启动子片段,并将其与含有GUS报告基因的表达载体融合,获得了融合表达载体;2) OsTLP12基因启动子区域含有多个生物和非生物逆境反应相关的顺式元件;3) 成功将融合表达载体转化进入水稻中,并筛选出阳性转基因幼苗;4) 对转基因幼苗进行了GUS染色,以检测OsTLP12基因启动子驱动的GUS表达情况。

蜡梅CpBEAT3启动子克隆及其互作蛋白的初步验证

苯甲醇乙酰基转移酶(benzyl alcohol acetyltransferase,BEAT)能够以苯甲醇和乙酰辅酶A(acetyl-CoA)为底物催化合成乙酸苄酯,是植物乙酸苄酯生物合成代谢途径下游的关键酶。CpBEAT3是蜡梅叶中调控乙酸苄酯生物合成的关键基因,为了解析其在蜡梅乙酸苄酯生物合成中的转录调控机制,本研究克隆得到了CpBEAT3基因启动子区序列,使用生物信息学软件预测分析了该基因核心启动子区、顺式作用元件、CpG岛等结构特征,并通过酵母单杂交技术筛选可能与CpBEAT3结合的上游调控因子。结果表明,2115 bp的CpBEAT3核心启动子区可能位于-1844~-1794 bp处,有一个位于-1869~-1459 bp处且长度为410 bp的CpG岛,含有多种与光响应、激素调节、胁迫响应相关的顺式作用元件及多个转录因子结合位点。通过酵母单杂交技术筛选获得1个MYB类的转录因子,可以与CpBEAT3启动子结合。

山葡萄VaERF095基因表达及其启动子功能分析

【目的】克隆山葡萄乙烯响应因子基因VaERF095及其启动子序列,分析在低温和外源激素诱导下该基因的表达模式和启动子活性,为深入探究VaERF095基因参与低温胁迫响应机理提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法从山葡萄品种左山-1中获得VaERF095基因及其启动子,并通过实时荧光定量PCR检测VaERF095基因在低温(4℃)胁迫和外源激素诱导下及不同组织中的表达情况。同时构建VaERF095基因启动子融合GUS蛋白表达载体,瞬时转化葡萄叶片,通过β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性定量分析VaERF095基因启动子受低温胁迫和外源激素诱导的表达情况。【结果】从山葡萄克隆获得VaERF095基因,编码区(CDS)全长393 bp,编码130个氨基酸残基,该蛋白含有1个保守的AP2/ERF结构域,与欧洲葡萄和河岸葡萄的亲缘关系较近,氨基酸序列相似性分别为100.00%和93.08%。Va ERF095基因可响应低温和外源激素乙烯(ET)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)的诱导,呈现出不同的表达模式。VaERF095基因在老叶、茎、花序、卷须和果实均有表达,其中在卷须中的表达量最高,在幼叶中的表达量极低或几乎不表达。克隆获得长度为1360 bp的VaERF095基因启动子,含有2个低温响应元件(LTR)、1个ET响应元件(ERE)、1个SA响应元件(TCA-element)、2个MeJA响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、1个ABA响应元件(ABRE)、1个GA响应元件(P-box)和1个防御和胁迫响应元件(TC-rich repeats)。在低温胁迫及外源激素(ET、SA和ABA)诱导下,VaERF095基因启动子活性较对照极显著升高(P<0.01),在MeJA诱导下,VaERF095基因启动子活性显著增强(P<0.05)。【结论】VaERF095基因及其启动子正向响应低温(4℃)及外源激素(ET、SA、ABA和MeJA)的诱导,具有明显的组织表达特异性。

汉族人群Toll样受体3基因启动子区rs128912单核苷酸多态性与白内障的关系

目的:分析汉族人群Toll样受体3(TLR3)基因启动子区rs128912单核苷酸多态性(SNP)与白内障的关系。方法:选取2019-06/2021-06我院收治的白内障患者263例作为研究组,晶状体脱位患者150例作为对照组。采用免疫印迹法(Western blotting)检测两组患者晶状体前囊膜组织中TLR3蛋白表达情况,采用直接测序法分析TLR3基因启动子区rs128912位点多态性,采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测不同基因型患者外周血TLR3 mRNA表达情况。结果:研究组患者前囊膜组织中TLR3蛋白相对表达水平高于对照组(P<0.05)。研究组和对照组患者TLR3基因启动子区rs128912位点基因型(AA、AT、TT)频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,且两组患者间TLR3基因启动子区rs128912位点基因型(AA、AT、TT)频率和等位基因(A、T)频率均有差异(P<0.05)。研究组中TT基因型患者外周血TLR3 mRNA相对表达水平均高于AA和AT基因型患者(P<0.05)。结论:白内障患者晶状体前囊膜组织中TLR3蛋白表达明显上调,且TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与汉族人群白内障易感性有关,携带TT基因型者更易发生白内障。

钩藤UrLAMT基因及其启动子的克隆与分析

【目的】克隆钩藤(Uncaria rhynchophylla)中马钱苷酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase,LAMT)基因及其启动子,对UrLAMT基因的组织表达及其对生物和非生物胁迫的响应进行分析,并对UrLAMT及其启动子的生物信息学进行分析,为进一步研究UrLAMT转录调控奠定基础。【方法】基于钩藤的转录组数据设计引物,采用PCR从钩藤cDNA中克隆UrLAMT序列,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR,分析UrLAMT在钩藤不同组织(根、茎、叶、花、果实、钩)中的表达,以及对外源茉莉酸甲酯(MeJA)、遮光/复光胁迫的响应;利用FPNI-PCR技术克隆UrLAMT上游启动子序列,并验证其活性,结合酵母单杂交试验,分析相应转录因子与UrLAMT启动子的调控关系。【结果】克隆得到钩藤UrLAMT序列,其长度为1137 bp,共编码378个氨基酸。UrLAMT蛋白质相对分子质量为42.64 ku,理论等电点为5.76,为亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构,定位在细胞质中;UrLAMT基因在钩藤叶中表达量最高,其次为根;UrLAMT均能响应MeJA和光;其与短小蛇根草和长春花的进化关系较近。UrLAMT启动子序列长度为1141 bp,除核心响应元件外还含有多个光响应元件,UrLAMT启动子在酵母中与光调控转录因子HY5存在相互作用。【结论】获得了UrLAMT基因及其启动子序列,其在钩藤叶中表达量最高,可能受光诱导。

转录因子NF-κB对鲤疱疹病毒Ⅱ型基因启动子的表达调控研究

为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 h,CyHV-2编码基因转录和翻译水平均明显高于对照组,提示NF-κB促进CyHV-2编码基因的转录及翻译。为进一步阐明NF-κB如何影响CyHV-2的转录和翻译,利用生物信息学软件预测CyHV-2部分编码基因的启动子序列中和NF-κB的结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验分析NF-κB对启动子活性的影响。结果表明,NF-κB过表达提高了病毒基因启动子活性,提示NF-κB可以通过促进CyHV-2基因的启动子活性来增强病毒复制水平。研究结果有助深入探究CyHV-2基因的表达翻译机制,也为开发基于NF-κB信号通路靶点的新的抗病毒抑制剂提供理论支撑。

CD_(4)^(+)T淋巴细胞穿孔素基因启动子低甲基化水平在戒烟大鼠肺气肿进展中的作用及S-腺苷甲硫氨酸的干预效果

目的探讨CD_(4)^(+)T淋巴细胞穿孔素基因启动子甲基化水平与戒烟后大鼠肺气肿持续进展的关系及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的干预效果。方法将20只SD大鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、戒烟4周组、戒烟后SAM干预4周组,各5只,后3组香烟烟雾暴露法建立大鼠肺气肿模型并采取相应措施。各组取右下肺组织行苏木精-伊红(HE)染色观察病理学改变,测量平均内衬间隔(MLI)和平均肺泡数(MAN)。用免疫磁珠法从各组大鼠的脾脏中分选出CD_(4)^(+)T淋巴细胞,提取其DNA,检测CD_(4)^(+)T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域的甲基化水平。结果模型组、戒烟4周组、戒烟后SAM干预4周组MLI均较正常对照组增加(均P<0.05),其中戒烟4周组较模型组、戒烟后SAM干预4周组增加(均P<0.05)。模型组、戒烟4周组、戒烟后SAM干预4周组MAN均较正常对照组减小(均P<0.05),其中戒烟4周组较模型组减小(P<0.05)。模型组和戒烟4周组CD_(4)^(+)T淋巴细胞穿孔素基因启动子甲基化水平均低于正常对照组和戒烟后SAM干预4周组[(93.9±3.1)%、(93.1±1.8)%比(97.1±1.1)%、(96.4±1.5)%](均P<0.05)。结论CD_(4)^(+)T淋巴细胞穿孔素基因启动子低甲基化水平在大鼠戒烟后仍持续存在,可能是戒烟后大鼠肺气肿不断恶化的原因之一;而给予SAM干预后,戒烟大鼠的肺气肿恶化可好转。

蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR法检测

为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉米泛素基因的启动子(pUbi)、烟草的花蕊特异性TA29的基因发育调节启动子(pTA29)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子(tE9)、章鱼碱合成酶终止子(t OCS)、谷氨酰胺转移酶7终止子(tg7)、花椰菜花叶病毒终止子(tCaMV35S))为研究靶标,进行10种启动子和终止子的引物和探针组合筛选、反应条件优化、灵敏度测定、质控品测试比对等实验,建立3组多重实时荧光PCR反应体系,并将其应用于市售蜂蜜的检测。结果表明:建立的3组多重实时荧光PCR反应体系能精准检出目的基因,其灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL;14种转基因质控品的测试显示多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的检测结果一致;40份市售蜂蜜的筛查中,有两份蜂蜜检出pCaMV35S和tNOS,其余未检出,该方法大大提高了检测效率。该方法为蜂蜜中转基因成分的检测提供了快筛快检技术,同时也适用其它产品转基因成分的检测。

海南黑山羊ATG16L2基因启动子区多态性研究

旨在研究海南黑山羊ATG16L2基因启动子区的结构特征及其遗传分布情况,为进一步探索该基因的表达调控机制及功能提供理论依据。本研究以200头海南黑山羊为研究对象,构建DNA混池,采用Sanger法测序对海南黑山羊ATG16L2基因启动子区的多态性进行初筛,应用PCR-RFLP技术对200头海南黑山羊个体进行基因型鉴定。对筛选到的SNP位点进行连锁不平衡分析,构建单倍型。利用生物信息学方法分析SNP位点对海南黑山羊ATG16L2基因表达的影响。在海南黑山羊ATG16L2基因启动子区共检测到3个SNPs位点,分别为SNP1(g.30667970T>C)、SNP2(g.30668540T>C)和SNP3(g.30668664C>T),且彼此连锁。SNP1和SNP2位点均表现为中度多态性,SNP3位点表现为低度多态性,且符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。单倍型分析结果显示,H1、H2、H3和H4单倍型频率分别为0.321、0.304、0.271和0.097,且H1(CGC)为优势单倍型。生物信息学分析显示,山羊ATG16L2基因共预测到3个启动子和4个CpG岛区域;存在2个重复元件LINE2(-1989~-1826 bp、-562~-426 bp)、hAT-Charlie(-1804~-1511 bp)以及5个CCAAT-Box、13个CAAT-Box、10个CGCG-Box、11个GATA-Box和2个TATA-Box。综合多种在线软件预测发现,上述SNPs可能通过影响ATG16L2基因的启动子区的顺式作用元件,从而影响海南黑山羊ATG16L2基因的转录表达。本研究在海南黑山羊ATG16L2基因启动子序列中发现3个SNPs位点,其中SNP1和SNP2表现为中度多态性,SNP3表现为低度多态性,并预测这些SNPs可能影响转录因子结合,从而调控基因表达,为进一步探究ATG16L2基因功能及其调控机制提供了理论依据。