山羊卵泡卵母细胞体外受精及受精卵的体外发育

对山羊卵泡卵母细胞的体外成熟、体外受精及受精卵体外培养的系列研究表明，在成熟培养液中添加１５μｇ／Ｌ重组牛生长激素（ｒｂＧＨ），与ＦＳＨ和ＬＨ配合使用，卵泡卵母细胞的成熟率（６７．９％）显著高于不含ｒｂＧＨ的培养组（５３．１％，Ｐ＜０．０５）；３８．５℃和３９．０℃的培养温度对卵泡卵母细胞体外成熟培养的影响无显著差异（Ｐ＞０．０５）；ＢＯ液上浮法对山羊冷冻精子的活精子分离效果优于Ｐｅｒｃｏｌ分层液法，并得到较高的受精率（６４．３％∶４９．０％，Ｐ＜０．０５）；颗粒细胞单层和输卵管上皮细胞单层的共同培养体系均有益于受精卵的体外发育。

山羊卵泡卵母细胞的采集及体外成熟效果研究

为了获取高质量的卵泡卵母细胞,提高山羊体外胚胎生产的效率,采用切剖法与抽吸法采集卵泡卵母细胞,并对获得的可用卵母细胞进行了体外成熟培养。结果表明,切剖法能够获得较多的可用卵母细胞,可以明显增加用于体外成熟的卵母细胞数;卵母细胞的体外成熟率与卵泡直径密切相关,大卵泡与中卵泡的卵母细胞成熟率明显高于(P<0.05)小卵泡;山羊卵泡卵母细胞的体外成熟培养液中FCS的添加比例以10%～15%为益。在一定范围内,提高FCS的浓度,并不能提高卵母细胞的成熟率。

牛卵泡卵母细胞冷冻保存的研究

研究了用 3种不同方法 (A法 :程序冷冻 ;B法 :超快速冷冻 ;C法 :玻璃化冷冻 )冷冻保存的牛 GV期卵母细胞的发育潜力。结果表明 ,解冻后 ,C组卵母细胞形态正常率显著高于 A、B组 ;3种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后 ,平均卵丘扩展率为 6 5 % ,其中 C组最高 (6 9% ) ;3组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率和卵裂率分别为 14 .3% ,17.1% ,2 1.6 % ;11.1% ,12 .6 % ,15 .1%和 5 .6 % ,9.1% ,11.1%。结果还表明 :玻璃化冷冻的卵母细胞损伤较轻。

波尔山羊活体采卵与卵母细胞体外受精技术

对10只不孕不育波尔母山羊采用超数排卵、活体采卵、卵母细胞体外成熟培养以及体外受精等技术方法,探讨其是否能正常繁育后代。试验中6只供体经超数排卵处理,在发情前利用特制的采卵装置进行活体采卵,共采集到30枚形态学正常的卵母细胞。经过体外成熟培养,有21枚成熟卵母细胞进行了体外受精处理和培养,获得16枚2 细胞胚胎,移植到4只同期发情的当地山羊受体输卵管内,经妊娠检验,有两只受体受孕,其中1只受体产出正常羔羊2只。该技术经进一步改进完善后可望作为不孕不育波尔山羊繁殖后代的辅助生育技术。

重组牛生长激素对山羊卵泡卵母细胞体外成熟的影响

将３０７枚Ａ、Ｂ级卵丘－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）分别培养于：改良ＴＣＭ１９９＋ＦＳＨ（１０μｇ／ｍｌ）＋ＬＨ（２０μｇ／ｍｌ）＋２０％ＮＣＳ（Ａ液）、Ａ液＋重组牛生长激素（ｒｂＧＨ）１５ｎｇ／ｍｌ、改良ＴＣＭ１９９＋ｈＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）＋ｒｂＧＨ＋２０％ＮＣＳ三种培养基中，获得５３１％、６７９％和６３５％的成熟率。结果表明，ｒｂＧＨ对山羊卵泡卵母细胞的体外成熟是有益的。

山羊卵泡卵母细胞低温冷冻保存研究

通过对冷冻液(1,2—丙二醇浓度和冷冻基础液)以及平衡和脱去防冻剂方法的筛选,研究了山羊卵泡卵母细胞的低温冷冻保存的可能性。结果表明,当冷冻液为含有10％1,2—丙二醇的生理盐水,并以五步法平衡和脱去防冻剂时,冷冻效果最为有效。解冻后,卵泡卵母细胞的回收率和形态正常率分别为96.6％(56/58)和75.8％(44/58),形态正常卵泡卵母细胞的成熟率为16.3％(2/12)。

卵泡颗粒细胞维持山羊卵母细胞减数分裂抑制状态的研究

通过在卵母细胞体外成熟过程中添加不同浓度的卵丘细胞或其外围壁层颗粒细胞进行共培养,对山羊卵母细胞成熟过程中卵泡颗粒细胞对卵母细胞减数分裂抑制作用及作用机制进行了探索。结果表明,成熟液中添加105和106个/mL卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞的卵母细胞体外成熟率与对照组相比差异不显著(p>0.05),但添加5×106个/mL(41.2%)和107个/mL(24.6%)卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞组的成熟率显著降低(p<0.05);添加5×106和107个/mL卵丘细胞组和颗粒细胞组卵丘不能正常扩展,卵母细胞核状态观察,停留在GV期;Rp-cAMP(Rp-cyclicadenosine monophosphothioate)膜渗透性cAMP对抗剂,诱导了107个/mL的卵丘细胞组(71.6%)和外围壁层颗粒细胞组(71.3%)的卵母细胞体外成熟率与对照组(72.0%)差异不显著(p>0.05)。在山羊卵母细胞体外成熟过程中,添加一定浓度的卵丘细胞及其外层的颗粒细胞可以提高卵母细胞胞质内的cAMP的水平,抑制卵母细胞减数分裂的启动,使卵母细胞停留在GV期。

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。

促性腺激素对山羊卵母细胞体外成熟的影响

为了建立针对山羊卵母细胞的理想体外成熟培养体系,本试验研究了在成熟培养液中添加不同浓度的促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)、促黄体素(luteinizing hormone,LH),不同来源的FSH+LH对山羊卵母细胞体外培养成熟效果的影响。结果表明,采用TCM199添加10%FCS,1～2mg/L17β-E2,10mmol/LHepes,0.055mg/mL丙酮酸钠,2.2mg/mL NaHCO3,500μg/mL链霉素,500μg/mL青霉素,10mg/L FSH及20mg/LLH的培养体系,有利于山羊卵母细胞的体外成熟;进口的和国产FSH和LH对山羊卵母细胞成熟有相同促进效果。

羊卵母细胞冷冻保存研究进展

近年来,绵羊、山羊胚胎工程技术的快速发展致使对卵母细胞的需求量越来越大。此外,作为家畜种质资源保护体系的组成部分,卵母细胞也是保存优秀雌性家畜遗传资源的重要方式之一。然而,作为胚胎生物技术的重要环节,由于其自身特殊的结构功能特点,卵母细胞对低温和冷冻极其敏感,其冷冻保存研究水平远低于胚胎。因此,如何提高冷冻保存卵母细胞质量是低温生物学和胚胎生物技术研究领域的热点和难点。针对目前绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存的最新研究进展和存在问题进行综述,同时针对如何进一步提高绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存质量提出建议,以期为之后的研究工作提供理论指导。

不同冷冻方法对牛卵泡卵母细胞发育潜力的影响

本试验探讨了不同方法冷冻保存的牛卵泡卵母细胞体外受精后的发育潜力。尽管用不同方法冷冻的牛卵母细胞大多 ( 79.1 % )形态正常 ,但体外受精后的受精率 ( 1 3.2 % )和卵裂率( 8.8% )均明显低于对照组 ( 66.7%和 46.0 % ) ,卵裂后继续发育的能力严重受损。在 3种方法中 ,玻璃化冷冻效果最好 ,受精率分别达到 1 5 .0 %和 1 1 .1 % 。

波尔山羊卵泡卵母细胞的体外培养和输卵管配子移植

从 4头同期发情与超数排卵的因重复采胚不孕的供体波尔山羊卵巢采得 2 4枚卵泡卵母细胞 (18枚卵丘卵母细胞 ,6枚裸卵 ) ,其中 9枚卵丘卵母细胞直接与获能后的精子实施配子输卵管内移植 ,4头受体均未受孕 ;其余 15枚进行 2 6h成熟培养 ,经培养后其中 9枚卵丘卵母细胞中有 6枚卵丘扩散 ,3枚未扩散 ;6枚裸卵因均退化而弃去。 9枚卵丘卵母细胞移植至 4头受体后有两头妊娠并如期产羔各一头。

玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究

为了提高玻璃化冷冻保存山羊卵母细胞的效果,试验用不含Ca2+的玻璃化冷冻液1[30%乙二醇(EG)]、玻璃化冷冻液2[27.5%EG+2.5%二甲基亚砜(DMSO)]和玻璃化冷冻液3(25%EG+5%DMSO)研究抗冻保护剂DMSO和EG的不同浓度配比对山羊卵母细胞形态正常率、孤雌激活率、体外受精卵裂率及胚胎发育能力的影响。结果表明:山羊卵母细胞经玻璃化冷冻液1,2,3处理后细胞形态正常率(97.1%、97.3%、97.3%)与对照组(100%)相比有所降低,但差异不显著(P>0.05),且对卵母细胞均不产生具有化学毒性作用的孤雌激活;山羊卵母细胞经3种玻璃化冷冻液冷冻保存后,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率(13.8%)显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%)(P<0.05)。说明采用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的效果。

卵泡大小和颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

用切割法采集卵泡液,收集卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocytes comlexs,COCs)和自然裸卵,将部分COCs去除卵丘细胞获得机械裸卵,COCs放入体外成熟培养液中培养为成熟卵母细胞,加入获能的精子液,进行体外受精。结果表明:卵母细胞的体外成熟率和卵裂率与卵泡直径密切相关,大卵泡(80.95%,P<0.01)和中等卵泡(75.50%,P<0.05)的卵母细胞成熟率高于小卵泡(50.27%);大卵泡(53.53%)和中等卵泡(47.13%)的卵裂率显著高于小卵泡的32.26%(P<0.05)。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为75.0%、54.2%和10.5%,差异极显著(P<0.01),卵裂率分别为53.8%、10.8%和0%,差异极显著(P<0.01)。对照组和1×105、1×106个/mL颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为68.6%、69.6%和67.8%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1×107个/mL(51.5%,P<0.05)和1×1010个/mL(35.5%,P<0.05)颗粒细胞组,但各组间的体外受精率无显著差异(P>0.05)。结果提示,大卵泡和中卵泡的卵母细胞的体外成熟率和卵裂率显著高于小卵泡,体外成熟培养液中添加高浓度的颗粒细胞能显著抑制卵母细胞的体外成熟。

山羊卵泡大小对卵母细胞体外发育能力的影响

目的比较不同大小山羊卵泡的卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的能力。方法收集不同大小山羊卵泡的卵母细胞,分3组进行体外培养。Ⅰ组:卵泡直径≥5.0mm;Ⅱ组:卵泡直径3.0～4.9mm;Ⅲ组:卵泡直径<3.0mm。观察各组卵母细胞体外成熟率、体外受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果3组卵母细胞体外成熟率与受精率差异无统计学意义(均P>0.05)。Ⅲ组卵母细胞的卵裂率及囊胚形成率分别为53.8%和28.6%,均显著低于Ⅰ组和Ⅱ组(均P<0.01)。结论在进行山羊未成熟卵体外成熟培养时,卵泡直径≥3mm的卵母细胞体外发育潜能较卵泡直径<3mm的卵母细胞好。