牛脂联素基因cDNA克隆

应用RT-PCR方法先提取成牛肝脏外部脂肪和犊牛大网膜前脂肪细胞培养物(第13日龄)总RNA,先后扩增出ADPN cDNA的501 bp片段基因,分别克隆到载体PMD18-T中,构建重组载体PMD18-T/牛ADPN1和PMD18-T/牛ADPN2。筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。结果表明：ADPN1和ADPN2 2次测序结果完全一致；从脂肪组织总RNA中扩增得到501 bp片段ADPN基因,其cDNA序列与GenBank牛ADPN基因序列同源性为85%,其氨基酸同源性为96%。

桑树转录因子CBF1基因的克隆及序列特征与低温应激表达

CBF(C-repeat binding factor)是一类与植物抗逆应答相关的转录因子。利用RT-PCR和RACE技术克隆桑树CBF1基因的全长cDNA序列,命名为MCBF1(GenBank登录号:JX186750)。该基因序列全长1 134 bp,包括693 bp的开放阅读框,87bp的5'端非翻译区和354 bp的3'端非翻译区;预测其编码的氨基酸序列具有保守的AP2结构域,且该结构域的两端拥有CBF家族特有的短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR,与其它植物CBF1的序列相似性较高;基于CBF1序列的系统进化树显示桑树与柑橘(Citrus jambhiri)、垂枝桦(Betula pendula)和切花月季(Rosa hybrid cultivar)的亲缘关系较近。将构建的pET28a-MCBF1原核表达载体转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MCBF1重组蛋白分子质量大小与预测值一致。半定量RT-PCR分析MCBF1基因在未经过低温处理的对照桑苗幼叶中无表达,而在低温处理后的桑苗幼叶中有表达,其中低温处理4 d后的表达量最高。克隆的MCBF1基因编码蛋白质具有典型的CBF家族结构域,并具有低温诱导表达的特点,推测其在桑树对低温的耐受性中发挥作用。