佳木斯市淡水鱼养殖中霍乱弧菌耐药性及ctxA基因检测

从佳木斯市淡水鱼养殖场、销售场所、餐饮店中随机采取水体、水体沉积物、水产品样品,按照监测手册常规进行霍乱弧菌株分离和血清分型检测,并采用PCR方法对菌株进行ctxA毒力基因检测,应用WHO推荐的改变K-B纸片法对15种抗菌药物进行药敏试验。从而分析佳木斯市淡水鱼养殖销售及餐饮环节中霍乱弧菌污染情况。

霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达

目的构建霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxA上切下ctxA基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子pcDNA3.1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxA转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果重组质粒pcD-NA3.1-ctxA成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达,用Westernblot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29 ku的蛋白。结论成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxA,并在NIH3T3细胞中表达出29 ku的CTA蛋白。

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因(ctxA)的融合表达载体,并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基(CTA)免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板,PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-CTA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET-ctxA,经SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。

2005年上海市霍乱弧菌菌株表型及ctxA毒力基因分析

目的:分析本市2005年不同来源O1群和O139群霍乱弧菌菌株表型和ctxA毒力基因特征。方法:以PCR方法,对所有菌株进行ctxA毒力基因检测。采用WHO推荐的改良K-B纸片法,对所有菌株均进行了12种抗菌药物的药敏试验。结果:从病人和外环境中分离出的O139群霍乱弧菌均为产毒株;从病人中分离出的O1群霍乱弧菌流行株均产毒,外环境中分离出的非流行株少数也产毒。O139群霍乱弧菌菌株耐药谱较O1群霍乱弧菌菌株广;两者对氨苄青霉素、强力霉素、庆大霉素、复方新诺明、利福平耐药率有显著差异。结论:本市2005年霍乱的流行株都是产毒株,但产毒株不一定是流行株。药敏结果显示,对O1群和O139群霍乱弧菌应采取不同抗菌治疗,O139群霍乱弧菌多重耐药应引起重视。

霍乱弧菌毒力基因LAMP方法快速检测

目的建立快速、特异检测霍乱弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法针对霍乱弧菌毒素基因(ctxA)设计4条引物,建立环介导等温扩增检测方法,优化反应体系,测定方法的特异性和灵敏度,并进行鱼肉模拟样品和实际样品检测。结果 LAMP最佳反应条件为8.0 mmol/L Mg2+、0.6 mmol/L d NTPs、1.6μmol/L FIP和BIP(2条内引物)、0.2μmol/L F3和B3(2条外引物);对细菌纯培养物的检测灵敏度为10 cfu/m L,对鱼肉模拟样品检测灵敏度为102cfu/g;在16份实际样品中检测出4份ctxA基因阳性。结论建立的LAMP方法灵敏度高、特异性强,可快速地检测食品样品中霍乱弧菌。

广东省中山市非O1/非O139群霍乱弧菌分子特征及耐药性

目的了解中山市非O1/非O139群霍乱弧菌的分子特征以及耐药情况,为霍乱防治提供实验室依据。方法收集中山市2015—2021年分离自散发患者及水产品监测的非O1/非O139群霍乱弧菌,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对菌株进行鉴定及图谱聚类分析,采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法对菌株进行ctxA毒力基因检测,采用脉冲场凝胶电泳法(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)对菌株进行聚类分析,采用微量肉汤稀释法对菌株进行药物敏感试验。结果2015—2021年中山市共分离出33株非O1/非O139群霍乱弧菌,其中28株分离自散发患者,5株分离自水产品。经MALDI-TOF-MS鉴定,33株非O1/非O139群霍乱弧菌均能鉴定到种的水平,鉴定结果均为霍乱弧菌。33株非O1/非O139群霍乱弧菌中,有1株携带ctxA毒力基因,耐药菌株占69.7%(23/33),多重耐药菌株占18.2%(6/33),共产生7种耐药谱,其中3种为多重耐药谱,对8种试验药物存在耐药现象,其中对链霉素、头孢唑林、复方新诺明的耐药率均超过30%。33株非O1/非O139群霍乱弧菌分为32个PFGE型别,各型别相似度为61.7%~100%,MALDI-TOF-MS图谱聚类分析将33株非O1/非O139群霍乱弧菌分为两大聚类。结论中山市非O1/非O139群霍乱弧菌分子分型结果呈多样性,PFGE和MALDI-TOF-MS图谱聚类分析之间未发现明显相关性。菌株对部分抗菌药物存在不同程度的耐药现象,存在多重耐药菌株和产毒株,应警惕非O1/非O139群霍乱弧菌的危害性并加强监测。

广东省霍乱病例与环境来源霍乱弧菌的耐药性和分子分型研究

目的比较分析广东省霍乱病例及环境来源O1/O139群霍乱弧菌抗生素敏感性和分子分型特征。方法选取2006-2007年广东省霍乱病例及相关来源、环境(珠江水体和海水产品)来源的O1/O139群霍乱弧菌。采用血清学、药物敏感性试验和分子生物学方法,研究不同来源的霍乱弧菌在菌型分布、药物敏感性、毒素基因携带以及分子分型方面的异同。结果2006-2007年,广东省共分离各类来源O1/O139群霍乱弧菌170株。其中,病例及相关来源菌株37株,环境来源菌株133株(海水产品来源37株、珠江水体96株)。两种来源菌株的菌型构成均以O1群E l Tor稻叶型为主;病例及相关来源菌株以产毒株为主,ctxA毒素基因携带率(83.8%)显著高于环境菌株(4.5%);药物敏感性试验显示,以产毒株为主的病例及相关来源菌株对萘啶酸和复方新诺明的耐药率(78.8%,78.8%)高于以非产毒株为主的环境来源菌株(50.6%,13.9%,P<0.05)。环境来源菌株对多西环素的耐药率(17.7%)高于病例及相关来源菌株(0%,P<0.05)。O139群菌株对氨苄西林的耐药率(70%)高于稻叶型和小川型菌株(8.9%,0%,P<0.01)。脉冲场凝胶电泳(PFGE)聚类分析显示,O139群霍乱弧菌产毒株之间,O1群霍乱弧菌流行株之间以及其他的O1/O139群霍乱弧菌之间,PFGE型别表现为明显的遗传多样性。结论广东省O1/O139群霍乱弧菌来源复杂多样,霍乱防控形势严峻,需要密切注意菌株型别变异情况及菌株变异趋势。

2013年-2015年广州市水体及水产品霍乱弧菌监测分析

目的了解广州市2013年-2015年霍乱弧菌在外环境水体及水产品中的污染状况,为制定防控策略提供科学依据。方法 2013年-2015年每月均采集广州市水体和水产品样本进行霍乱弧菌培养,对分离得到的阳性菌株进行血清分型、荧光定量PCR检测毒力基因、K-B法药敏试验。结果 2013年-2015年共检测样品1 440份,分离出霍乱弧菌37株,总阳性检出率为2.57%。其中外环境水体监测阳性率为3.61%,水产品监测阳性率为1.53%,蛙类阳性率最高为21.05%。阳性菌株的优势血清型为O1群稻叶型,从水体中检出1株肠毒素阳性。药敏结果显示,对环丙沙星、诺氟沙星、头孢曲松、头孢噻肟未产生耐药。结论广州市水体及水产品存在霍乱弧菌,应加强监测力度,及时了解其污染状况,以便采取有针对性措施预防和控制霍乱的发生和流行。

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。