霍乱弧菌ctxB基因真核重组质粒的构建及表达

目的构建霍乱孤菌ctxB基因真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxB上切下ctxB基因,导入真核表达载体pcDNA3·1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3·1-ctxB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3·1-ctxB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法对pcDNA3·1-ctxB的瞬时表达产物进行鉴定。结果约380bp的ctxB被克隆到pcDNA3·1(+)真核表达载体中,经测序无误后,用阳离子脂质体转染的方法,检测到重组质粒pcDNA3·1-ctxB在NIH3T3细胞的胞浆和胞膜上得到了表达。结论ctxB真核表达的成功构建及表达为进一步从分子水平研究霍乱肠毒素B亚单位的免疫原性及其作为佐剂的应用价值提供研究基础。

嗜肺军团菌mip/ctxB融合基因体外表达与动物免疫试验的免疫原性研究

PCR扩增嗜肺军团菌mip基因和霍乱弧菌ctxB基因,克隆入载体pcDNA3 1( +),重组子经限制性酶切分析、PCR、序列分析鉴定正确后,命名为pcDNA3 1 mip/ctxB.脂质体法将重组质粒pcDNA3 1 mip、pcDNA3 1 mip/ctxB转染NIH3T3细胞,用免疫荧光法和蛋白质印迹鉴定瞬时表达和稳定表达产物,结果发现:重组质粒成功转入细胞并获得短暂表达,稳定转染细胞分别在 2 4ku和 35ku处检测到阳性杂交信号.将pcDNA3 1 mip、pcDNA3 1 mip/ctxB作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN γ产生水平、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性等体液免疫和细胞免疫反应的指标,评价疫苗的免疫原性.结果发现:各实验组均检测到免疫原性,pcDNA3 1 mip/ctxB免疫组的免疫原性高于pcDNA3 1 mip免疫组,有显著性差异(P <0 0 1).

嗜肺军团菌mip/ctxB融合基因动物免疫试验的免疫保护性研究

目的初步评价mip基因DNA疫苗的免疫保护性.方法将20只6～8周龄、体重25 g左右的BALB/c雌性小鼠,随机分为空白对照组、pcDNA3.1(+)阴性对照组、pcDNA3.1-mip免疫组、pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组4个组.每只小鼠股四头肌肌肉注射进行免疫接种,初次免疫2周后加强免疫1次,加强免疫2周后,小鼠腹腔注射嗜肺军团菌L1菌液进行攻击.攻击28 d后,检测小鼠肺组织培养带菌量和肺组织病理形态学变化.结果 pcDNA3.1-mip免疫组和pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组肺组织培养带菌量少于空白对照组和阴性对照组(ANOVA,P＜0.05).小鼠肺组织肉眼未见明显病理变化,在显微镜下观察肺组织病理切片,发现空白对照组与阴性对照组主要表现为渗出性病变,可见肺泡膈明显增宽,肺毛细血管扩张充血,明显的中性粒细胞浸润,肺泡腔内有渗出物;而应用DNA疫苗的两个免疫组无渗出性病变,pcDNA3.1-mip免疫组肺泡壁和肺间膈轻度增厚,pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组肺泡壁和肺泡膈略微增厚.结论应用mip基因DNA疫苗能诱导小鼠在体内产生一定的免疫保护效应.

弗氏志贺菌2a T32株asd基因缺失突变体的构建

构建痢疾弗氏志贺菌 2aT32的asd基因全缺失突变体。方法 :采用全菌PCR技术 ,从痢疾弗氏 2aT32株染色体扩增了asd基因及其上下游各约 50 0bp的染色体DNA序列 ,并将其克隆至 pUC18,测定其核苷酸序列 ,在体外用ctxB基因置换了asd基因 ,然后将其克隆至自杀载体pXL2 75。通过细菌交配和体内同源重组 ,用ctxB基因完全取代痢疾弗氏 2aT32株染色体上的asd基因。结果与结论 :构建成asd基因全缺失而稳定表达CtxB的T32突变株FWL0 1,为进一步用载体 /宿主平衡致死系统构建多价菌苗候选株打下了基础。

痢疾基因工程三价菌苗候选株的构建

通过DNA体内外同源重组, 用霍乱毒素B亚单位基因(ctxB)完全取代了福氏志贺氏2a T32株染色体上的asd基因, 获得了稳定表达CtxB的DAP依赖株FWL01. 随后, 用T32株的asd基因标记志贺氏宋内S7株的Ⅰ相大质粒, 并将其诱动至FWL01, 构成三价菌苗候选株FSW01. 在该菌苗候选株中, 表达宋内Ⅰ相O抗原的大质粒与宿主菌是平衡致死的. 因此, 该候选株在没有任何抗生素存在情况下, 能稳定地表达福氏 2a, 宋内O抗原和CtxB. 豚鼠眼角膜试验和HeLa细胞侵袭试验证明FSW01无毒, 家兔免疫试验证实了其有很好的免疫原性. 小鼠和猴体免疫保护试验显示该候选株对相应的有毒株攻击具有很好的保护效果.