绵羊肺源大肠杆菌cyaA基因缺失对小鼠肺泡巨噬细胞感染的影响

为研究cyaA基因编码的腺苷酸环化酶(AC)在绵羊肺源大肠杆菌XJ10感染小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)中的作用,本研究以绵羊肺源大肠杆菌XJ10野毒株(XJ10WT)为对照,通过荧光定量PCR检测XJ10 cyaA基因缺失株(XJ10ΔcyaA)在感染MH-S细胞过程中与黏附侵袭相关的motA、crl、fimH、pap基因的m RNA转录水平,结果显示,与XJ10WT相比,XJ10ΔcyaA在感染MH-S细胞过程中与黏附侵袭相关的motA、crl、fimH、pap基因的m RNA转录水平在感染后0和6 h时均极显著降低(P<0.001),crl和pap基因的m RNA转录水平分别在2 h和12 h时均极显著上调(P<0.001)。进一步通过吉姆萨染色观察XJ10WT和XJ10ΔcyaA黏附MH-S细胞情况,采用细胞和细菌共培养方式分析XJ10ΔcyaA对MH-S细胞的黏附及侵袭能力,并通过CCK-8法分析细菌对MH-S细胞增殖的抑制情况。结果显示,XJ10ΔcyaA和XJ10WT在感染后3 h黏附MH-S细胞的活菌数量达峰值并持续至5 h,随后逐渐下降,在感染后1 h~5 h的时间段内,XJ10ΔcyaA黏附MH-S细胞的活菌数量均极显著低于XJ10WT(P<0.001)。XJ10ΔcyaA和XJ10WT侵袭MH-S细胞的活菌数量随着感染时间的延长逐渐升高,5 h时达到峰值,后持续下降,XJ10ΔcyaA在感染后1 h~10 h侵袭MH-S细胞的活菌数量均显著或极显著低于XJ10WT。在感染MH-S细胞后的3 h~6 h,XJ10ΔcyaA对细胞增殖的抑制率均极显著低于XJ10WT(P<0.001)。上述结果首次表明,cyaA基因表达的AC可以显著上调绵羊肺源E.coli与黏附侵袭相关基因的转录水平,并参与绵羊肺源E.coli对MH-S细胞的黏附与侵袭,抑制MH-S细胞增殖。本研究为绵羊肺源E.coli致病机制的研究奠定了基础。

绵羊肺源大肠杆菌cyaA基因缺失对细菌致病力及生物被膜形成影响的研究

为了研究cyaA基因缺失对XJ10的生化特性、生物被膜(BF)形成以及致病力的影响,试验将复苏后的XJ10和XJ10-ΔcyaA涂布于LB培养基,37℃培养过夜后观察菌落形态;通过生化鉴定仪对XJ10和XJ10-ΔcyaA的单菌落进行生化鉴定;采用96孔聚苯乙烯微孔板培养XJ10和XJ10-ΔcyaA,观察不同时间段BF形态;对昆明系小鼠进行腹腔注射,通过观察小鼠精神状态及死亡数来研究XJ10与XJ10-ΔcyaA的毒力。结果表明:与XJ10相比,XJ10-ΔcyaA的菌落形态未发生明显改变,但是生长缓慢,且直径明显小于XJ10的菌落;XJ10-ΔcyaA对蔗糖、侧金盏花醇、D-麦芽糖、β-半乳糖苷酶、D-甘露醇、D-海藻糖、D-山梨醇反应均为阴性,失去了对它们的利用能力;XJ10可以形成完整的BF,但XJ10-ΔcyaA未形成BF;小鼠毒力检测发现XJ10-ΔcyaA的致病性降低。说明cyaA基因可以影响XJ10对部分碳源的利用,缺失cyaA基因的XJ10的BF形成能力以及致病力都明显下降。