急性脑出血模型大鼠脑组织中差异表达基因测序的验证及功能分析

背景:急性脑出血中存在差异表达的基因,这些基因与脑出血发生发展有关。目的:筛选急性脑出血大鼠模型脑组织中差异表达的基因和关键基因,并采用qPCR进行验证,分析关键基因与脑出血后神经功能、脑组织含水量的关系。方法:78只SD大鼠随机分为2组:脑出血组大鼠于右侧尾状核部位注射胶原酶构建脑出血模型,假手术组大鼠于相同部位注射等量生理盐水。运用TRIzol法将2组大鼠的脑组织提取出RNA,转录组测序,筛选急性脑出血脑组织的差异表达的基因,经过qPCR验证,分析基因与脑出血后神经功能、脑组织含水量的关系,并结合生物信息学对关键基因进行GO、KEGG功能富集分析。结果与结论:①筛选出10个关键基因,分别是CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E、CCL20;②脑出血组的关键基因GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E含量低于假手术组(P<0.05),CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、CCL20含量高于假手术组(P<0.05);③关键基因GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E含量与脑组织含水量、神经功能缺损评分正相关(P<0.05),CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、CCL20含量与脑组织含水量、神经功能缺损评分负相关(P<0.05);④GO分析显示基因在生物过程差异表达基因主要富集于白细胞趋化性、趋化因子介导的信号通路;细胞组成差异表达基因主要富集于阳离子通道复合物、离子通道复合物;分子功能差异表达基因主要富集于门控通道活动、离子通道活动;⑤KEGG分析示基因集中于TNF信号通路、谷氨酸能突触、GABA能突触;⑥结论:在脑出血中出现差异表达的基因为CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E、CCL20,这些基因与脑出血后脑组织含水量、神经功能相关,这些基因主要富集在细胞组分、结合功能、细胞突起等相关的生物学功能上。

高原肺水肿大鼠肺组织基因表达谱分析

目的利用基因芯片技术分析高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,HAPE)大鼠模型肺组织差异表达基因,为深入探讨HAPE发生的分子机制提供新线索。方法将8周龄健康雄性SD大鼠[体质量(200±20)g]按随机数字表法分为常氧对照(NC)组、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)组、低压低氧(Hypoxia)组和低压低氧复合低剂量LPS(HL)组。LPS组和HL组按照每100 g体质量尾静脉注射0.1 mL浓度为0.05%的LPS溶液,NC组和Hypoxia组给予等量生理盐水;Hypoxia组和HL组进行模拟海拔5000 m低压低氧处理6 h,NC组和LPS组于舱外同时饲养。检测肺组织的湿/干质量比(wet/dry mass ratio,WDR)、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)蛋白含量,HE染色观察肺组织病理改变。提取肺组织总RNA,采用Affymetrix基因芯片检测mRNA表达谱,采用Metascape在线基因注释和分析系统(http://metascape.org)对差异表达基因进行基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路聚类分析。结果HL组大鼠肺组织表现出明显的充血、水肿、肺泡间隔增宽。与NC组比较,HL组大鼠肺WDR显著增加(P<0.01),BALF蛋白含量显著升高(P<0.05)。基因表达检测发现,相对NC组,Hypoxia组有79个基因表达上调,59个基因表达下调,LPS组473个基因表达上调,695个基因表达下调,HL组669个基因表达上调,1253个基因表达下调。GO和KEGG信号通路聚类分析显示:HL组差异表达上调基因主要富集于细胞因子介导的信号通路、对IL-1的反应、炎症反应调节等生物学过程,以及细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF、NF-κB、IL-17、补体和凝血级联反应等信号通路;表达下调的基因主要富集到细胞外基质组织、内皮细胞迁移调控、细胞-基质黏附等生物学过程,以及黏着斑、Wnt、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Rap1等信号通路。HL组大鼠肺组织中NF-κB、TNF-α、IL-1β以及IL-6的mRNA表达均显著上调(P<0.01)。结论低氧复合低剂量LPS可稳定复制大鼠HAPE模型,低氧可显著增强LPS诱导的炎症、免疫反应,显著增强炎症介质的表达,促进HAPE的发生发展。

结球甘蓝CBF家族特征分析及低温诱导基因BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3表达分析

转录因子CBF在植物对低温胁迫的响应和增强植物的抗寒性方面发挥着重要作用。为分析结球甘蓝CBF家族成员的氨基酸序列特征,探究其是否受低温诱导表达,本研究利用结球甘蓝923全基因组数据库对其进行蛋白质理化特征、系统发育关系、编码基因结构以及2℃低温胁迫下编码基因表达水平分析。结果表明,共鉴定到7个BoCBF基因,系统发育分析后分成2个亚组(Ⅰ和Ⅱ)。BoCBF蛋白的氨基酸长度为203~283 aa,全部是亲水性蛋白质。在结球甘蓝02-12中,BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因在叶、花、芽和角果中基本不表达,在愈伤组织、根和茎中表达量较低。转录组测序和实时荧光定量PCR分析发现,在耐寒结球甘蓝923和不耐寒结球甘蓝D9中,BoCBF2b、BoCBF2c基因不受低温诱导表达,BoCBF2a基因低温诱导表达最为迅速,其次是BoCBF1和BoCBF3基因。BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因的相对表达量在低温胁迫3~6 h达到最大值,相对表达量达到最大值后急剧下降,在24 h降至最低。本研究结果为后续开展BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因调控结球甘蓝响应低温胁迫机理研究奠定了基础。

羽衣甘蓝BoLMI基因的克隆及时空表达分析

【目的】探究羽衣甘蓝裂叶表型形成的分子机制,研究BoLMI基因对裂叶形成的作用。【方法】以裂叶羽衣甘蓝DH系为试验材料,利用同源克隆技术,成功获取基因完整的cDNA序列,将其命名为BoLMI。【结果】序列分析发现,BoLMI基因全长531个碱基对,共编码176个氨基酸,其蛋白分子量为20 789.35 Da,理论等电点为7.24。根据Pfam保守结构域分析,BoLMI蛋白包含homeobox保守结构域。系统发育分析结果显示,羽衣甘蓝的BoLMI基因与甘蓝型油菜以及结球甘蓝的BoLMI基因同属于一个分支,亲缘关系较近。BoLMI蛋白是位于细胞核内的可溶性蛋白,包含1个跨膜结构域,无信号肽序列。qRT-PCR分析表明,BoLMI基因在裂叶羽衣甘蓝的幼苗期表达水平较高,在莲座期表达水平较低;在羽衣甘蓝莲座期,裂叶品种不同部位叶片BoLMI基因的表达水平均高于圆叶品种,其中在第1片叶的表达量最高。裂叶品种和圆叶品种不同叶片BoLMI基因的表达量差异显著。【结论】推测BoLMI基因在羽衣甘蓝裂叶形成中起重要作用,为加速羽衣甘蓝叶形育种提供了理论基础。

MC1R基因在白羽乌骨鸡和黑羽乌骨鸡肌肉和皮肤中的表达分析

本试验旨在探明MC1R基因在白羽乌骨鸡和黑羽乌骨鸡黑色素沉积中的影响效应,为更好地开发利用地方乌骨鸡提供理论依据。以白羽乌骨鸡(丝羽乌骨鸡、竹丝鸡)和黑羽余干乌骨鸡为研究对象,屠宰拔毛后立刻测定胸部皮肤、大腿部皮肤的亮度L^(*)值,然后把测定过肤色的胸皮和大腿皮剪开,测定皮肤下面的胸肌、腿肌亮度L^(*)值,获得胸肌、腿肌、胸皮和大腿皮乌色度的变化趋势,同时比较MC1R基因在3种乌骨鸡的4种组织中的差异表达量。结果发现:2~17周龄期间,随着周龄的增加,3种乌骨鸡腿皮、胸皮、胸肌和腿肌L^(*)值均呈增加趋势;2周龄时MC1R在3种乌骨鸡胸肌、腿肌中的相对表达量较高,随后表达量呈现下降趋势,而在3种乌骨鸡胸皮和腿皮中的表达量变化趋势不同;2周龄时MC1R基因在黑羽余干乌骨鸡腿肌、胸皮和腿皮中的表达量显著大于2种白羽乌骨鸡;6周龄时MC1R基因在黑羽余干乌骨鸡腿肌和胸皮的表达量显著大于2种白羽乌骨鸡;10周龄时MC1R基因在黑羽余干乌骨鸡腿肌的表达量显著大于2种白羽乌骨鸡;10、12、17周龄时MC1R在丝羽乌骨鸡腿皮的表达量显著高于其他乌骨鸡;MC1R基因表达量与黑羽余干乌骨鸡肤色和肉色L^(*)值不相关,而与白羽乌骨鸡腿肌L^(*)值显著相关。结果提示,MC1R基因对白羽乌骨鸡和黑羽乌骨鸡黑色素沉积的影响效应不同,本研究为培育乌色度更高、不同羽色的乌骨鸡新品种提供了科学理论依据。

薄壳山核桃CiSPL2基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆薄壳山核桃SQUAMOSA启动子结合蛋白(SPL)转录因子基因CiSPL2,并对其进行亚细胞定位及表达分析,为探究该基因在薄壳山核桃雌花发育过程的分子机制提供理论依据。【方法】根据薄壳山核桃基因组数据,采用RT-PCR方法克隆CiSPL2基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件分析其序列特征和蛋白理化性质,构建pCAMBIA1300-CiSPL2-GFP融合表达载体,瞬时转化烟草后观察荧光信号确定亚细胞定位情况。基于转录组数据和实时荧光定量PCR检测CiSPL2基因在不同组织及不同雌花芽分化时期的表达模式。【结果】薄壳山核桃CiSPL2基因CDS长度为1398 bp,共编码465个氨基酸残基,相对分子量为51.78 kD,理论等电点(p I)为8.28,不稳定系数为49.89,脂肪酸氨基酸指数为64.62,平均亲水性平均值(GRAVY)为-0.617,为不稳定的亲水性蛋白,含有SBP结构域(位于第183~257位氨基酸),亚细胞定位于细胞核。CiSPL2蛋白的二级结构主要由α-螺旋(17.42%)、延伸链(13.55%)、β-转角(1.72%)和无规则卷曲(67.31%)组成。薄壳山核桃CiSPL2蛋白与核桃JrSPL2蛋白氨基酸序列的相似性最高,为95.05%,其次是光皮桦BlSPL2蛋白,相似性为70.83%。CiSPL2蛋白与核桃JrSPL2蛋白亲缘关系最近。CiSPL2基因启动子中含有植物激素响应、干旱胁迫响应和分生组织表达元件。CiSPL2基因在雌花和果实中的表达水平显著高于其他组织(P<0.05),在雌花芽分化各阶段均有表达,在雌花序形成期表达水平最高。【结论】CiSPL2基因含有SPL转录因子家族典型的SBP保守结构域,推测其参与调控薄壳山核桃雌花芽分化和发育过程。

木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建

MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。

基于加权基因共表达网络分析识别肥胖型多囊卵巢综合征的关键基因

目的 采用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)方法识别肥胖型多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)的关键基因,探讨肥胖型PCOS的发病机制。方法 从基因表达数据库(gene expression omnibus, GEO)下载GSE5090芯片数据,通过WGCNA算法分析筛选基因共表达关键模块和核心基因,对关键模块进行GO和KEGG分析,对核心基因进行差异分析以确定肥胖型PCOS的关键基因。结果 在GSE5090芯片数据中,通过WGCNA分析构建出了31个共表达基因模块,其中重褐色模块(MEsaddlebrown)与肥胖型PCOS具有密切的相关性,包含53个基因。对此模块基因进一步筛选,识别出了ZNF492、MED17、CRABP1、KCNV2、KRI1、ACSBG2、MACO1、SCLY、CPSF1、MAGEA8 10个肥胖型PCOS核心基因。对此模块基因进行GO和KEGG分析发现相关基因与脂肪酸代谢关系密切,主要作用于核蛋白,通过调节染色体组织、有机酸分解等发挥生物学功能。进一步对核心基因表达量进行差异分析,基因ZNF492、CRABP1、KCNV2在肥胖对照组与肥胖型PCOS脂肪组织间存在明显差异。结论 ZNF492、CRABP1和KCNV2基因在肥胖型PCOS的发展中可能产生重要生物学意义,其具体机制有待进一步研究。

笼养密度对公母分饲黄羽肉鸡生长性能、免疫器官发育、抗氧化能力、肠道组织形态及免疫相关基因mRNA表达的影响

本试验旨在探讨笼养密度对公母分饲黄羽肉鸡生长性能、免疫器官发育、抗氧化能力、肠道组织形态及免疫相关基因mRNA表达的影响。选用21日龄黄脚麻鸡720只,3层层叠式笼内饲喂,鸡笼规格为长×宽×高=1.2 m×0.8 m×0.4 m,公鸡和母鸡分开饲养,均随机分为4组(每组5个重复),笼养密度分别为15(低密度组)、17(中密度组)、19(中高密度组)和21只/m 2(高密度组)。试验期42 d。结果表明:1)对于公鸡,21~42日龄时,高密度组平均日采食量显著低于低密度组和中密度组(P<0.05);43~63日龄时,中高密度组和高密度组平均日采食量显著低于低密度组和中密度组(P<0.05),中高密度组和高密度组平均日增重显著低于低密度组(P<0.05)。对于母鸡,21~42日龄时,中高密度组和高密度组平均日采食量显著低于低密度组(P<0.05),高密度组平均日增重显著低于低密度组(P<0.05);43~63日龄时,高密度组平均日采食量显著低于低密度组和中密度组(P<0.05),中高密度组平均日增重显著低于低密度组(P<0.05)。2)对于公鸡,低密度组肝脏重量显著低于其他各组(P<0.05),肝脏指数显著低于高密度组(P<0.05)。3)对于母鸡,中密度组血清超氧化物歧化酶活性显著高于高密度组(P<0.05),中高密度组血清丙二醛含量显著高于高密度组(P<0.05)。4)对于公鸡,中密度组空肠绒毛高度/隐窝深度显著高于高密度组(P<0.05)。对于母鸡,高密度组十二指肠隐窝深度显著高于中高密度组(P<0.05),中高密度组十二指肠绒毛高度/隐窝深度显著高于高密度组(P<0.05);高密度组空肠绒毛高度显著低于中密度组和中高密度组(P<0.05),高密度组空肠绒毛高度/隐窝深度显著低于低密度组(P<0.05);高密度组回肠隐窝深度显著高于其他各组(P<0.05)。5)对于公鸡,中高密度组空肠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)。对于母鸡,中高密度组空肠核因子E2相关因子2(Nrf2)和Toll样受体4(TLR4)mRNA相对表达量显著高于低密度组(P<0.05)。由此可见,高笼养密度会对黄羽肉鸡生长性能、抗氧化能力、肠道组织形态等相关指标产生影响;笼养密度可能通过影响肠道抗氧化和免疫相关基因表达影响黄羽肉鸡肠道免疫功能。

穿心莲糖苷水解酶基因ApGH的克隆、生物信息学分析及表达研究

目的:对穿心莲糖苷水解酶(ApGH)基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析。方法:取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框(ORF)设计特异性引物,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式。结果:克隆所得ApGH基因的ORF全长1734 bp,编码577个氨基酸(GenBank登录号:OR887606)。ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1家族。将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中成功表达出重组蛋白质。实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低。结论:克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达。研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据。

草莓FaWRKY70基因克隆与表达模式分析

【目的】WRKY是植物特异性转录因子家族之一,参与植物多种生命活动,但在草莓中鲜见WRKY70相关报道。深入解析WRKY70同源基因在草莓响应胁迫过程中的作用,加快分子育种技术应用,培育新草莓种质资源。【方法】用同源克隆法从‘红颜’草莓果实中克隆得到FaWRKY70基因,用生物信息学分析其保守结构域、理化性质、蛋白质结构及进化关系等,并结合qRT-PCR数据进行表达模式分析。【结果】FaWRKY70基因全长1020 bp,编码339个氨基酸;同源基因比对发现,FaWRKY70与苹果、牡丹等同科物种氨基酸序列相似度较高,且同源基因多与植物对生物、非生物胁迫响应相关,暗示FaWRKY70可能参与草莓抵御胁迫的过程;FaWRKY70在草莓不同器官中均有表达,且差异显著,在花中表达量最高,在果实中最低;水杨酸处理后,FaWRKY70基因快速响应,表达量在3 h后达到最高,随后逐渐降低;茉莉酸甲酯处理后FaWRKY70基因受诱导响应程度小,整体呈下调趋势。【结论】FaWRKY70能通过不同响应方式参与草莓生命活动及激素信号转导过程。

大白菜BrCYP83B1基因的克隆及表达分析

【目的】细胞色素P450家族是十字花科植物硫苷合成重要的酶系,其中CYP83亚家族主要参与核心结构的合成,旨在探究大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)CYP83B1基因的功能。【方法】利用RT-PCR技术克隆BrCYP83B1基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白理化性质、同源性及启动子顺式作用元件,利用RT-qPCR技术分析BrCYP83B1的表达模式,并构建其植物超表达载体。【结果】BrCYP83B1 cDNA序列全长为1500 bp,编码499个氨基酸,编码蛋白属于细胞色素P450超家族,主要定位于细胞质,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,与甘蓝型油菜、青花菜的CYP83B1蛋白具有较高的同源性。启动子分析表明,该基因启动子区域包含水杨酸、脱落酸及茉莉酸甲酯等激素响应的顺式作用元件,说明BrCYP83B1基因表达可能受激素调控。RT-qPCR分析结果表明,BrCYP83B1基因在大白菜的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;茉莉酸甲酯够显著促进该基因的表达,而水杨酸处理对其表达具有一定的抑制作用,脱落酸处理下基因先上调后又下调。【结论】BrCYP83B1可能参与大白菜对激素的响应调控。

气单胞菌属低温淀粉酶基因改造与原核表达

【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计特异引物,PCR扩增获得C13片段,将其克隆到pMAL-2X,转化到BL-21(DE3)中,筛选蓝白斑,验证PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切,获得高效表达生物工程菌株pMAL-2X-C13。设计定点突变引物,以pMAL-2X-C13为模板,获得低温淀粉酶基因突变株三株C19、C29、C43。【结果】表达蛋白的分子大小为114kD,突变菌株C19蛋白表达量均高于pMAL-2X-C13。【结论】低温淀粉酶基因突变株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表达量更高。

小麦倒春寒响应基因TaJAZ6的克隆、表达模式及亚细胞定位分析

JAZ蛋白在植物生长发育和胁迫信号通路中具有关键作用。为探究JAZ蛋白在小麦倒春寒中的调控机制,从小麦幼穗中克隆了TaJAZ6基因,并对其分子特征、表达特性与亚细胞定位进行分析。结果表明,该基因CDS序列全长为549 bp,编码178个氨基酸,预测编码蛋白质的分子质量为18.376 ku,理论等电点为9.37,不稳定系数为62.44,属于不稳定蛋白。该基因编码蛋白质具有1个TIFY结构域和1个CCT_2结构域。系统进化树分析发现,该蛋白质与野生二粒小麦和乌拉尔图小麦TIFY 11b蛋白亲缘关系最近。TaJAZ6基因启动子区除含有CAAT-box、TATA-box等基础作用元件外,还含有激素类响应元件、光响应元件、低温响应元件、防御和应激反应元件等。实时荧光定量PCR分析发现,TaJAZ6基因在根、茎、叶和幼穗中均有表达,根系中表达量最高。TaJAZ6基因还受低温和茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导表达,低温胁迫下,TaJAZ6在矮抗58(耐倒春寒)和郑麦366(倒春寒敏感)根、茎和叶中表达趋势相同,均显著升高;喷施300,350μmol/L的MeJA之后再低温处理TaJAZ6在2个小麦品种中表达量均显著下降。TaJAZ6在低温胁迫后的幼穗中表达量出现相反的趋势,在矮抗58幼穗中表达量显著下降,在郑麦366幼穗中则显著上升,推测该基因可能负调控了小麦倒春寒胁迫防御反应。通过喷施MeJA显著降低了低温胁迫下2个小麦品种幼穗中TaJAZ6基因的相对表达量,同时提高了小麦的结实粒数。亚细胞定位试验显示,TaJAZ6蛋白定位于细胞核中。以上研究结果表明,TaJAZ6可能在小麦响应倒春寒胁迫过程中发挥重要作用。

芝麻热胁迫响应基因SiHsfB-2b的克隆及表达特性分析

为探究B类热激转录因子(HSFs)在芝麻耐热性中的分子功能,基于前期转录组分析鉴定到的编码B类HSF家族蛋白HsfB2b的基因序列,以郑太芝3号耐热白芝麻品种为材料,采用同源克隆方法克隆了芝麻SiHsfB-2b基因,对其进行生物信息学分析,同时分析其在芝麻不同器官和热胁迫下的表达特性,并对其进行亚细胞定位。结果表明:SiHsfB-2b基因CDS序列全长为936 bp,编码311个氨基酸;系统进化树分析表明SiHsfB-2b与松蒿、独脚金和锈鳞木樨榄的同源蛋白关系较近,含保守DNA结合结构域;亚细胞定位于细胞核内;SiHsfB-2b基因启动子区域含有13类顺式作用元件,其中与胁迫响应和激素响应相关的各有3类。RT-qPCR分析结果显示,热胁迫可诱导SiHsfB-2b在芝麻根、茎和叶中上调表达,叶中相对表达量最高;在持续高温胁迫下,SiHsfB-2b在芝麻茎和叶中的表达量呈上升趋势,且在胁迫后期的叶中表现出显著上调,而根中的表达量呈现出先上升后下降趋势。综上推测,SiHsfB-2b基因可能通过介导胁迫和激素信号等通路积极响应热胁迫,这可为后期深入研究芝麻耐热性的分子机制奠定理论基础。

基于RNA-Seq技术的山羊嘴唇黏膜色素沉积相关差异表达基因筛选及初步分析

【目的】通过RNA-Seq技术筛选不同颜色山羊嘴唇色素代谢相关的候选基因,初步揭示山羊嘴唇黏膜颜色差异形成的分子机理,为动物黏膜色素代谢研究提供理论依据。【方法】以嘴唇等面部可视黏膜颜色存在差异的酉州乌羊(乌黑色)和板角山羊(粉色)为研究对象,采用Illumina Hiseq 2000测序平台对嘴唇黏膜组织进行转录组测序,所得序列经质控、组装后,以|log_(2)(Fold Change)|>1且q value<0.05为标准筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行功能注释和富集分析。【结果】利用RNA-Seq技术共筛选出249个基因差异表达,其中与粉色嘴唇黏膜组织相比,乌黑色嘴唇黏膜组织中上调基因有218个,下调基因有31个。23个差异表达基因被划分在9种TFs家族中,其中14个基因属于含有锌指结构域的转录因子家族。GO功能富集分析结果显示,差异表达基因主要参与离子转运相关生物学过程和分子功能。KEGG代谢通路富集结果显示,差异表达基因显著富集于催产素、钙、cGMP-PKG信号通路,以及肥厚性心肌病、心脏肌肉收缩等7个与肌肉组织功能相关的信号通路,其中钙和cGMP-PKG信号通路与色素代谢密切相关;此外,ASIP等12个基因富集到MAPK信号通路、cAMP信号通路、黑色素合成信号通路(Melanogenesis)等色素代谢核心通路中;CALML6、OXTR、ATP1A2、ATP1B44个差异表达基因同时富集到多条与色素代谢相关的通路。qRT-PCR结果与测序结果一致,表明测序结果可靠。【结论】初步确定ASIP基因为山羊嘴唇色素代谢的候选基因,CALML6、OXTR、ATP1A2、ATP1B44个基因参与了山羊嘴唇黏膜色素沉积过程,为研究山羊黏膜色素代谢的分子机制提供理论基础,也为探究人类黏膜异常着色的分子机制提供参考。

基于重症支气管哮喘差异表达基因及其治疗中药筛选的生物信息学分析

目的:通过生物信息学方法探讨重症支气管哮喘[简称重症哮喘(SA)]的差异表达基因,分析其作用机制,并筛选潜在具有治疗作用的中药及活性成分。方法:在高通量基因表达(GEO)数据库中选取GSE136587和GSE158752数据集,利用R软件对数据集进行差异分析获得差异表达基因,并进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析,筛选核心基因,寻找关键通路和枢纽基因。最后将核心基因提交至Coremine数据库筛选具有潜在治疗作用的中药,并通过《中华医典》检索相关中药方剂。结果:共筛选出466个差异表达基因。通过STRING平台构建PPI网络共筛选包括25 kDa突触关联蛋白(SNAP25)、谷氨酸离子型受体2(GRIA2)、轴突蛋白1(NRXN1)、钾电压门控通道亚家族A成员1(KCNA1)、突触囊泡蛋白1(SYT1)和嗜铬蛋白A(CHGA)等核心靶点25个。基因本体(GO)功能富集显示SA的生物学过程与细胞趋化性和白细胞迁移等有重要关系,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集的通路主要涉及骨髓白细胞迁移、白细胞趋化性、细胞趋化性、白细胞迁移、对外部刺激反应的正向调节和骨髓白细胞活化等信号通路。采用网络药理学方法基于核心靶点筛选得到具有潜在治疗SA作用的中药367种,其中人参、水牛角、全蝎和黄芪等中药涉及多个核心靶点,与SA具有高度相关性,在《中华医典》中检索具有高度相关性的中药,共得到17个潜在具有治疗效果的中药方剂。结论:通过生物信息学筛选SA的潜在标志物和具有治疗作用的中药,为SA早期诊断和发病机制研究提供新的靶点,为其治疗的中药方剂研发提供思路。

不同氮含量对大球盖菇菌丝生长和碳氮代谢相关酶活性及基因表达的影响

通过研究液体培养时不同氮含量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)对菌丝生长、碳氮代谢相关酶活性及基因表达的影响,筛选大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)菌丝生长最适氮源。结果表明:豆粕粉是大球盖菇菌丝生长最适氮源。氮含量为0.6%时,菌丝生长速度最快。在实验范围内,对照(氮含量为0)的亚硝酸盐还原酶活性较高,1.2%氮含量的天冬酰胺合成酶活性较高,0.6%氮含量的谷氨酸合酶活性最高;0.6%氮含量的内切β-1,4-葡聚糖酶活性最高,β-1,3-葡聚糖酶活性较高;0.6%氮含量的谷氨酸合酶基因表达量最高,1.2%氮含量的谷氨酸脱氢酶基因表达量较高;对照的β-1,3-葡聚糖酶基因和半纤维素酶基因表达量均最高。研究结果可为大球盖菇液体菌种开发和应用提供参考。

辣椒EIL基因家族的鉴定及其在盐碱胁迫下的表达分析

EIL(Ethylene-insensitive 3-like)基因在参与植物乙烯信号通路的转导和生长发育过程中发挥着重要作用。为了解辣椒EIL基因家族成员信息,利用生物信息学手段对辣椒EIL基因家族成员的理化性质、蛋白质结构、系统进化、基因结构、保守域、启动子顺式作用元件及CaEILs基因在不同组织部位和不同非生物胁迫条件下的表达模式进行分析。同时使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对辣椒叶片中CaEILs在盐碱胁迫下的表达模式进行研究。结果表明,辣椒9个CaEILs分布在6条染色体上,氨基酸数目、蛋白质理论分子质量和脂肪系数分别介于209~677、23.77~76.07 ku和63.10~87.75,且主要为酸性、亲水的不稳定性核蛋白。系统进化分析显示,CaEILs被分成了4个亚家组,9个CaEILs在根、茎、叶、花蕾、花中具有不同程度的表达,而低温、高温、高盐、干旱胁迫下均能诱导CaEILs的表达,其对以上非生物胁迫均具有不同程度的响应。此外,利用qRT-PCR对盐碱胁迫下辣椒叶片中CaEILs进行了检测,结果发现,随着处理时间的延长,CaEIL1、CaEIL2、CaEIL4、CaEIL5、CaEIL8的表达量整体呈上升趋势,而CaEIL3、CaEIL6、CaEIL7、CaEIL9的表达量整体呈下降趋势。

CO_(2)升高对风信子鹿角珊瑚(Acropora hyacinthus)钙化速率和 基因表达的影响

本文以风信子鹿角珊瑚(Acropora hyacinthus)为研究对象,以三亚珊瑚礁海域自然海水培养的珊瑚样本为对照组,模拟本世纪末海水酸化状况,并开展珊瑚模拟培养试验。以此探究海水酸化对A.hyacinthus钙化和基因表达的影响。在酸化胁迫下,A.hyacinthus净钙化速率显著下降,基因表达受到显著影响,其中有机物运输、阴离子运输、化学应激等通路上调,动物器官发育、脂质转运、细胞生物合成、细胞表面受体信号等通路下调。与钙化相关的基因中,碳酸酐酶和溶质运载蛋白下调,但是Ca^(2+)-ATP酶和钙离子运输相关的基因上调。结果表明,高CO_(2)影响了A.hyacinthus的钙化和多个生物过程的基因表达,海水酸化可能通过抑制珊瑚碳酸酐酶等基因表达,减少HCO–3运输,最终降低钙化速率。