香港牡蛎cyclin B基因组织表达特征及其多克隆抗体制备

【目的】明确香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)B型细胞周期蛋白基因(cyclin B)组织表达特征,并通过原核表达融合蛋白制备多克隆抗体,为探究香港牡蛎cyclin B基因在环境胁迫下的表达特征及揭示cyclin B调控贝类细胞周期的作用机制提供理论依据。【方法】克隆香港牡蛎cyclinB基因c DNA序列,通过SignalP-5.0、ProtParam、TMHMM2.0、NetSurfP2.0及Bioedit7.0等软件进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测cyclinB基因在香港牡蛎不同组织中的表达情况;构建重组质粒pET32a-cyclin B并运用原核表达系统诱导表达融合蛋白,经Ni-NTA镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠源多克隆抗体,然后以间接ELISA检测多克隆抗体效价、Western blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】香港牡蛎cyclinB基因cDNA序列全长2353bp,包括1299bp的开放阅读框(ORF)、103 bp的5’非编码区(5’-UTR)和951 bp的3’非编码区(3’-UTR),共编码432个氨基酸残基。香港牡蛎cyclin B蛋白相对分子量为49.13 kD,理论等电点为7.16,不含信号肽和跨膜结构域。香港牡蛎cyclin B氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框,与来自同属的长牡蛎cyclin B氨基酸序列相似性最高(98.8%),基于cyclin B氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示香港牡蛎与长牡蛎的亲缘关系最近。cyclin B基因在香港牡蛎的闭壳肌、外套膜、性腺、鳃、唇瓣、消化腺等组织中均有表达,以性腺中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量(P<0.05)。通过原核表达获得的融合蛋白cyclin B具备良好免疫原性,且主要以包涵体形式存在;以其免疫BALB/c小鼠制备出的鼠源多克隆抗体效价大于1∶64000,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白。【结论】香港牡蛎cyclin B基因具有较高的保守性,其氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框;香港牡蛎cyclin B基因表达具有广谱性和组织差异性,在调控生殖细胞减数分裂过程中发挥作用。通过原核表达体系及免疫注射BALB/c小鼠制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体具有高效价,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白,为进一步探究香港牡蛎cyclin B的生物学功能与表达调控机理提供了技术支持。

cyclin D2、Bcl-2在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达意义

目的研究细胞周期蛋白D2(cyclin D2)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的表达意义。方法采用回顾性分析,观察对象为2017年3月至2022年3月入东莞市人民医院就诊的80例DLBCL患者与20例淋巴组织反应性增生(RLH)患者,分别设定为研究组与对照组,两组患者均经术后病理检查确诊,术前未行任何治疗。选取免疫组织化学法测定两组cyclin D2、Bcl-2蛋白表达情况,对cyclin D2、Bcl-2表达之间的相互关系及与DLBCL患者病理特征相关性进行分析。结果研究组cyclin D2蛋白阳性率、Bcl-2蛋白阳性率分别为33.75%(27/80)、62.50%(50/80),对照组cyclin D2蛋白阳性率、Bcl-2蛋白阳性率分别为5.00%(1/20)、10.00%(2/20);研究组cyclin D2蛋白阳性率、Bcl-2蛋白阳性率较对照组更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。cyclin D2蛋白表达、Bcl-2蛋白表达与DLBCL患者的免疫分型、Ann Arbor分期有明显相关性(P<0.05),与组织类型、肿瘤部位、性别及年龄无明显相关性(P>0.05)。DLBCL中cyclin D2与Bcl-2的表达呈正相关(r=1.000,P<0.05)。结论cyclin D2、Bcl-2在DLBCL中呈高表达,可能参与了DLBCL的发生及发展,两者具有协同作用,可辅助评价生物恶性程度。

B-myb在人肝细胞癌中表达的生物学意义及与cyclin D1相关性的研究

目的:研究人肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中B-myb及细胞周期素D1(cyclin D1)的表达,探讨其与肿瘤发生发展的关系。方法:采用免疫组化法检测60例肝癌组织及癌旁肝组织中B-myb和cyclin D1的表达情况。结果:B-myb、cyclin D1在癌组织中的阳性率分别为56.67%和50%,而在癌旁组织中的阳性率分别为36.67%和31.67%,癌组织与癌旁组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。B-myb在人肝癌组织中的表达与临床分期、肝外转移、术后复发及肿瘤个数相关,而与门静脉癌栓、肿瘤直径、血清AFP水平及肿瘤分化程度无明显相关性。cyclin D1在人肝癌组织中的表达与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发、肿瘤个数及肿瘤分化程度相关,而与肿瘤直径及血清AFP水平无明显相关。在癌组织中B-myb与cyclin D1的表达呈正相关。结论:肝癌组织中B-myb及cyclin D1高表达,可促使肝癌细胞增殖,与肝癌的发生发展密切相关。

DLBCL患者CD68、cyclin D1蛋白表达和BCL-6基因重排及与生存期的相关性分析

目的分析弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、CD68蛋白表达和B淋巴细胞瘤-6(BCL-6)基因重排及与生存期的相关性。方法回顾性选取98例均获随访的DLBCL患者石蜡标本,通过免疫组化法对其cyclin D1、CD68和BCL-6进行免疫标记,并通过荧光原位杂交技术对BCL-6基因重排进行测定。分析cyclin D1、CD68蛋白表达和BCL-6基因重排与生存期的相关性。采用单因素分析法分析cyclin D1、CD68蛋白表达和BCL-6基因重排与DLBCL患者临床病理特征的相关性,并分析DLBCL患者临床病理特征与预后效果的关系,同时采用多因素COX风险模型分析cyclin D1、CD68蛋白表达和BCL-6基因重排与DLBCL患者生存期的相关性。结果 98例患者随访时间为1~36个月,平均为(21. 54±4. 65)个月,其中死亡14例,死亡率为14. 29%。98例患者中,cyclin D1蛋白高水平表达37例(37. 76%),CD68蛋白高水平表达17例(17. 35%),BCL-6基因重排20例(20. 41%)。cyclin D1、CD68蛋白表达和BCL-6基因重排与患者年龄、性别、血清乳酸脱氢酶(LDH)含量、Ann Arbor分期、原发部位、国际预后指数(IPI)及化疗方案均无显著关系(均P> 0. 05)。单因素分析结果显示,性别、原发部位与患者预后均无显著相关性(P> 0. 05),而年龄≥60岁、Ann Arbor分期为Ⅲ~Ⅳ、血清LDH≥245 IU/L、IPI评分为3~5分、化疗方案为CHOP的患者预后均较差(P <0. 05)。cyclin D1蛋白高表达、CD68蛋白高表达、BCL-6基因重排患者的生存率明显低于cyclin D1蛋白低表达、CD68蛋白低表达、BCL-6基因未重排者(均P <0. 05)。多因素COX模型分析结果发现,cyclin D1蛋白高表达、CD68蛋白高表达、BCL-6基因重排与患者预后效果均存在显著关系(P <0. 05)。结论 cyclin D1、CD68和BCL-6基因与DLBCL患者预后效果均存在密切关系,其中cyclin D1、CD68蛋白高表达及BCL-6基因重排者预后情况较差,提示cyclin D1、CD68蛋白及BCL-6基因可作为评估DLBCL患者预后的重要指标。

近缘新对虾cyclin B基因的克隆与原核表达

采用RACE技术,克隆了近缘新对虾cyclin B基因,该序列全长1 667 bp,编码区1 209bp共编码402个氨基酸,所推导的氨基酸序列N端不存在信号肽。BLAST比对后发现,其氨基酸序列与刀额新对虾的同源性达90%。经RT-PCR检测,cyclin B基因在近缘新对虾的卵巢和肌肉中表达水平最高,胸神经节和心脏次之,鳃、眼柄神经节、肝胰腺几乎没有表达。推测主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关。原核表达结果显示,pET32a表达载体在0.2 mmol/L IPTG、25℃诱导4 h条件下可得到纯度较高的分子量约67 ku的蛋白。

细胞周期素D1对HBV转录和复制的影响

目的 探究细胞周期素D1(cyclin D1,基因名CCND1)对HBV复制的影响及其机制。方法 利用GSE84044数据集,采用Spearman秩相关分析HBV相关肝纤维化患者肝组织基因表达水平与血清HBV DNA载量之间的相关性。在HBV细胞复制模型中瞬时表达cyclin D1及cyclin D1持续激活突变体(T286A)蛋白,使用时间分辨免疫荧光及实时荧光定量PCR实验分别检测细胞培养上清液中的HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平,Western blot检测细胞内HBV core蛋白,反转录-实时荧光定量PCR法检测细胞内HBV RNA,双荧光素酶报告基因实验检测cyclin D1对HBV基本核心启动子(BCP)活性的影响。利用GSE83148数据集,分析CCND1与HBV相关调控因子表达的相关性。正态分布的计量资料两组间比较采用独立样本t检验;非正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U检验。结果 在GSE84044数据中,HBV相关肝纤维化患者的肝组织中有7个细胞周期调控基因与HBV DNA载量呈显著负相关(r值均<-0.3,P值均<0.05),其中包括CCND1基因(r=-0.474,P<0.001)。外源表达cyclin D1及cyclin D1 T286A突变体能降低HBV复制细胞模型培养上清液中的HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平,以及细胞内core蛋白和HBV RNA水平;外源表达cyclin D1显著抑制了HBV BCP的转录活性;且慢性乙型肝炎患者肝组织中CCND1表达水平与抑制HBV复制的APOBEC3G(r=0.575,P<0.001)、SMC5(r=0.341,P<0.001)和FOXM1(r=0.333,P<0.001)表达呈显著正相关,而与HBV进入受体NTCP(r=-0.511,P<0.001)和HBV复制正向调控转录因子HNF1α(r=-0.430,P<0.001)表达呈显著负相关。在HepG2细胞中过表达cyclin D1降低HNF1α及NTCP转录水平。结论 cyclin D1抑制HBV的转录和复制,可能与其下调HNF1α及NTCP表达有关。

基于生物信息学分析HBV感染相关肝组织中免疫微环境枢纽基因

目的 通过生物信息学分析HBV感染相关免疫机制,找出定位于HBV感染相关免疫微环境的潜在治疗靶点。方法 从基因表达综合数据库下载GSE121248和GSE55092数据集。使用limma R软件包筛选HBV阳性肝组织样本与正常肝组织样本间的差异表达基因(DEGs)。从GeneCards数据库中下载免疫相关基因集,与上述两组DEGs取交集后得到免疫相关的差异表达基因(i-DEGs)。利用i-DEGs构建蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络,以筛选可能与HBV感染相关的枢纽基因;使用多种网络工具评估枢纽基因与miRNA、转录因子、小分子药物的关联性。结果 从GSE55092和GSE121248分别获得1417和789个DEGs,二者与免疫相关基因集取交集后得到324个i-DEGs。通过构建PPI网络,鉴定出TOP2A、CDK1、AURKA、NCAPG、KIF11、CCNB1、CDC20、BUB1B、CCNB2、CCNA2共10个枢纽基因。通过探索DGIdb数据库,鉴定出可以调控TOP2A、CDK1、AURKA、CCNA2表达的36种小分子药物。进一步研究发现,CDK1对于HBV感染的诊断效能最高,其表达水平与HBV相关免疫微环境中的6种免疫细胞浸润水平显著相关。结论 本研究发现CKD1可能是调控HBV相关免疫微环境的关键靶点。

异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析

细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白B1基因的剪切方式,设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物,首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4kb和2.1kb的片段.测序及比对分析表明:这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT-AG规则,推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明:无论是外显子区还是内含子区,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性,在1025bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个,为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外,还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明:对于亲缘关系较近的物种,用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种,用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异.

核因子κB与细胞周期蛋白D1在骨肉瘤中的表达及相关性研究

目的 :探讨骨肉瘤细胞中核因子κB(NF κB)及细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达及其意义。 方法 :应用免疫组织化学SABC法 ,检测 4 6例骨肉瘤、15例骨软骨瘤和 5例正常骨组织中NF κBp6 5亚单位和cyclinD1表达 ,并比较NF κB表达在骨肉瘤组织学分级、分型间的差异及其与cyclinD1表达的关系。 结果 :NF κBp6 5亚单位显著表达于骨肉瘤细胞中 (6 7.4 % ) ,而在正常骨组织和骨软骨瘤中未见表达 ;NF κBp6 5表达与骨肉瘤组织学分级无关 ,在骨内高分化型组表达显著高于普通中心型组 (P<0 .0 5 )。cyclinD1在骨肉瘤中表达率为 73.9% ,显著高于骨软骨瘤组 (33.3% ,P <0 .0 5 ) ;骨肉瘤中NF κB p6 5与cyclinD1蛋白表达显著正相关 (r =0 .4 6 3,P <0 .0 1)。结论 :NF κBp6 5在骨肉瘤细胞中异常活化 ,并与cyclinD1过表达密切相关 ,其可能通过上调cyclinD1表达参与骨肉瘤的发生发展。

B细胞淋巴瘤/白血病-2基因、CD10和细胞周期蛋白D1在B细胞性非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及意义

目的探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、CD10和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)组织中的表达及临床意义。方法选择2017年6月至2019年8月新乡医学院第一附属医院收治的78例B-NHL患者(B-NHL组)和50例淋巴组织反应性增生患者(对照组)为研究对象。取B-NHL组患者肿瘤组织和对照组患者反应性增生淋巴组织,采用免疫组织化学染色法检测Bcl-2、CD10及cyclin D1表达,比较2组患者Bcl-2、CD10及cyclin D1表达情况;收集B-NHL患者临床病历资料,分析Bcl-2、CD10和cyclin D1水平与B-NHL临床病理特征的关系;对B-NHL患者随访1 a,统计患者病死情况,采用单因素分析和logistic回归分析影响预后的因素。结果 B-NHL组患者Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达率分别为78.21%(61/78)、38.46%(30/78)、87.18%(68/78),对照组患者Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达率分别为36.00%(18/50)、100.00%(50/50)、0.00%(0/50);B-NHL组患者Bcl-2、cyclin D1阳性表达率显著高于对照组(χ^(2)=22.971、92.992,P<0.01),CD10阳性表达率显著低于对照组(χ^(2)=49.231,P<0.01)。B-NHL患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置、临床分期与Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达无关(P>0.05);B-NHL患者的病理类型与CD10、cyclin D1阳性表达相关(P<0.05),与Bcl-2阳性表达无关(P>0.05)。B-NHL组患者病死20例(25.64%),生存58例(74.36%);肿瘤临床分期、病理类型、Bcl-2、CD10及cyclin D1表达与B-NHL患者病死相关(P<0.05),年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置与B-NHL患者病死无关(P>0.05)。Logistic回归分析结果显示,临床分期Ⅲ~Ⅳ期、病理类型为弥漫大B细胞淋巴瘤、Bcl-2阳性表达、cyclin D1阳性表达及CD10阴性表达是影响B-NHL患者死亡的独立危险因素(P<0.01)。结论 Bcl-2、CD10及cyclin D1在B-NHL组织中异常表达,其可能参与了B-NHL的发生、发展;CD10、cyclin D1检测可鉴别诊断不同病理类型的B-NHL,且可作为评估B-NHL患者预后的参考指标。

细胞周期调控基因及Bcl-2、c-Jun基因在人肝细胞脂肪变性过程中的表达变化

目的观察细胞周期调控基因及Bcl-2、c-Jun基因在人肝细胞L02脂肪变性过程中的表达变化。方法以油酸和软脂酸(2∶1)混合液处理L02细胞0、5、10、20 h,建立人肝细胞脂肪变性模型。用油红O染色检测L02细胞内脂质含量;用荧光定量PCR技术检测L02细胞脂肪变性过程中CDK2、CDK4、Cyclin D1、Bcl-2、c-Jun mRNA表达。结果随造模时间延长,L02细胞内橘红色脂滴聚集越来越多,至造模20 h,肝细胞染成橘红色。L02细胞内CDK2 mRNA相对表达量逐渐升高,造模5 h达最高(P均<0.05),随后逐渐下降;CDK4 mRNA相对表达量逐渐升高,造模10 h达最高(P均>0.05),随后逐渐下降,造模20 h最低(P均>0.05);不同时间点Cyclin D1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05);Bcl-2 mRNA相对表达量随造模时间延长而升高,造模10 h达最高(P<0.05),随后降低;造模5、10、20 h的c-Jun mRNA相对表达量均较造模0 h高(P均<0.05),但无变化规律。结论人肝细胞L02脂肪变性过程中癌症相关基因CDK2、CDK4、Bcl-2、c-Jun表达先升高后降低,Cyclin D1表达变化不明显。

刀额新对虾周期蛋白B基因的分子克隆及序列分析

周期蛋白B(cyclin B)是真核生物细胞周期的一种重要调控原件,通过调节周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CKD)的活性可以控制细胞周期.运用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆了刀额新对虾(Metapenaeus ensis)cyclin B基因.刀额新对虾cyclin B的cDNA全长为1 681bp,5′端非编码区为111bp,3′端非编码区为355bp,开放阅读框为1 215bp,编码404个氨基酸,平均分子质量为45 767.9u,pI为8.81.Blast比对后发现,其氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)的同源性达约90%.基于cyclin B序列所绘制的进化树基本上能反映出各物种间的进化关系.半定量RT-PCR结果显示,刀额新对虾的cyclin B基因在不同组织表达中具有明显的组织特异性,在鳃、卵巢和心脏中有较高的表达量,在眼柄神经节和胸神经节中表达量较低.推测该差异性主要与cyclinB在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关.

CDK1、CCNB1和NDC80与乙型肝炎相关肝细胞癌的预后和进展相关:基于生物信息学方法

目的探讨HBV转化为HCC相关的关键基因,并探索相关的分子机制。方法分析基因表达综合(GEO)数据库中GSE55092、GSE84044和GSE121248的mRNA微阵列数据,其中包括119个HBV相关的HCC组织和252个HBV相关的非肿瘤组织。“sva”R包用于去除批间差。进行整合分析,获取HBV相关肝癌和HBV组织中的差异表达基因(DEGs),通过基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析对差异表达基因进行功能注释。使用相互作用基因搜索工具(STRING)构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,挖掘最重要的模块和关键基因。cBioportal用于分析hub基因的相关性。利用Kaplan-Meier和Oncomine数据库对TCGA数据库中肝癌基因表达数据进行验证,探讨hub基因与肝癌发生、发展和预后的关系。通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)实验验证17对临床肝细胞癌样本与邻近非肿瘤组织中hub基因的表达。结果共获得121个DEGs(P<0.01),鉴定出3个遗传标记,细胞周期素依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)和核分裂周期蛋白80(NDC80),与细胞周期、嘧啶代谢和DNA复制有关,这3个基因高度相关(P<0.05)。UALCAN数据库证实这些基因在肝癌组织中高表达并获得相关预后信息。Kaplan-Meier表明,它们与HCC患者的低存活率相关。CDK1、CCNB1和NDC80与肝癌分级相关(P<0.05),RT-qPCR实验证实CDK1、CCNB1和NDC80的mRNA在肝细胞癌中的表达明显高于癌旁组织。结论CDK1、CCNB1和NDC80基因可作为HBV相关肝细胞癌的预后标志物,在肝癌的基础研究和临床治疗方面有一定的应用价值。

靶向着丝粒蛋白F的siRNA调节肝癌细胞增殖的实验研究

目的研究靶向着丝粒蛋白F(CENPF)的siRNA调节肝癌细胞增殖的作用及机制。方法培养肝癌细胞株中SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及正常肝细胞株HL-7702,检测细胞中CENPF的表达水平;HepG2细胞进行分组处理,转染阴性对照(NC)siRNA或CENPF siRNA,给予对照溶剂二甲基亚砜(DMSO)或ERK1/2激动剂表皮生长因子(EGF),检测细胞增殖A490水平及细胞中CENPF、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)的表达水平。结果肝癌细胞株中SMMC-7721、HepG2、BEL-7402中CENPF的表达水平高于正常肝细胞株HL-7702,差异有统计学意义(P<0.05);HepG2细胞中CENPF的表达水平最高;转染siRNA后,si-CENPF组HepG2细胞的A490水平及CENPF、CyclinD1、Bcl-2、p-ERK1/2的表达水平低于si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);转染siRNA的同时给予ERK1/2激动剂EGF,EGF+si-CENPF组HepG2细胞的A490水平及CENPF、CyclinD1、Bcl-2、p-ERK1/2的表达水平均高于DMSO+si-CENPF组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向CENPF的siRNA可显著抑制肝癌细胞的增殖,相关的分子机制可能是抑制ERK1/2的磷酸化并抑制下游CyclinD1、Bcl-2的表达。

cyclin D2和bcl-2在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其临床意义

目的:探讨cyclin D2和bcl-2在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的表达及其意义。方法:收集2015年1月至2020年3月在保定市第一中心医院手术切除的87例DLBCL组织及23例淋巴组织反应性增生(RLH)患者组织,采用免疫组织化学法检测DLBCL和RLH组织中cyclin D2和bcl-2蛋白的表达情况,分析二者表达间的相互关系及与DLBCL患者临床病理特征的关系。结果:DLBCL和RLH中cyclin D2蛋白阳性率分别为33.3%(29/87)、2.0%(1/23),bcl-2蛋白阳性率分别为60.9%(54/87)、7.0%(3/23);DLBCL中cyclin D2、bcl-2蛋白阳性率均高于RLH,差异均有统计学意义(χ^(2)=7.566, P=0.006;χ^(2)=17.512, P<0.01)。cyclin D2和bcl-2蛋白表达与DLBCL患者Ann Arbor分期、免疫分型有关(均 P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤部位、组织类型均无关(均 P>0.05)。cyclin D2和bcl-2蛋白在DLBCL中的表达呈正相关( r=1.000, P<0.01)。 结论:cyclin D2和bcl-2可能与DLBCL的发生、发展相关,两者可能有一定的协同作用。

小檗碱对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的调节作用

目的探讨小檗碱抑制肝癌HepG2细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用及可能机制。方法活细胞计数(CCK-8)法检测小檗碱对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测小檗碱对细胞凋亡及细胞周期的影响;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blotting)检测抗增殖基因BTG2及细胞周期蛋白CyclinD1的mRNA和蛋白的表达情况。结果小檗碱可以显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖,随着小檗碱作用浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用增强(P<0.01);小檗碱可使HepG2细胞周期阻滞在G1期,并促进细胞凋亡,凋亡率与小檗碱的作用时间成正比(P<0.05);随着小檗碱作用时间的延长,抗增殖基因BTG2 mRNA的表达增加(P<0.05);细胞周期蛋白CyclinD1 mRNA的表达则逐渐降低(P<0.01)。结论小檗碱能够抑制肝癌HepG2细胞的增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与其上调抗增殖基因BTG2和下调细胞周期蛋白CyclinD1的表达相关。

COX-2、CDKN2A在慢性乙型肝炎、肝硬化肝组织中的表达及意义

目的了解慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化肝组织中COX-2、CDKN2A的表达及其与肝脏损伤程度的关系。方法经免疫学及肝穿刺病理学证实为CHB患者46例、乙型肝炎肝硬化17例;正常肝组织10例(来自肝脏良性肿瘤手术切除的标本)。应用病理学判断肝组织的炎症及纤维化程度。采用免疫组化方法、半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹分析法检测COX-2、CDKN2A在组织中的表达。结果 (1)CDKN2A mRNA第一、第二外显子在正常肝、CHB及肝硬化组织的表达水平及CDKN2A蛋白的半定量分析差异有统计学意义(F=28.75、24.86、26.43,P=0.036、0.041、0.038)。(2)正常肝、CHB及肝硬化组织中的COX-2、CDKN2A蛋白水平的表达差异有统计学意义(χ2=13.48、15.73,P=0.042、0.021);肝组织炎症不同级别的COX-2、CDKN2A蛋白水平的表达差异具有统计学意义(χ2=22.45、23.67,P=0.038、0.027);肝组织纤维化不同程度的COX-2、CDKN2A蛋白水平的表达差异具有统计学意义(χ2=24.16、22.53,P=0.024、0.037)。结论 COX-2、CDKN2A表达与CHB、肝硬化发生发展过程明显相关,COX-2、CDKN2A可作为反应HBV相关肝病进展程度的良好指标。

三角帆蚌cyclin B基因克隆及功能

通过现代分子生物学技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆了细胞周期蛋白B(cyclin B)基因的cDNA,得到长度为1024 bp的序列信息,包括768 bp的ORF,197 bp的3′-UTR,编码255个Aa。进一步分析表明,三角帆蚌cyclin B基因与牡蛎、扇贝具有较高的相似性,其氨基酸序列中具有1个典型的周期蛋白框(cyclin-box),并存在2个周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的作用位点。通过RT-qPCR研究显示:三角帆蚌cyclin B基因在性腺中的表达最高,在雌性中的表达量显著高于雄性(P<0.05);而cyclin B基因在其他组织中的表达量均显著低于性腺(P<0.05),且无显著雌雄差异(P>0.05);沉默cyclin B基因后,除外套膜外,其在性腺和鳃的表达显著降低(P<0.05),表明RNA干扰(RNAi)对三角帆蚌不同组织具有不同的沉默效果。流式细胞仪测定RNAi后细胞的分裂时相变化,发现性腺和鳃细胞中G2/M期占比下降,表明cyclin B基因在三角帆蚌中能调控细胞分裂。初步研究了三角帆蚌cyclin B基因及其功能,为三角帆蚌细胞体外建系奠定分子基础。

CD68、cyclin D1蛋白和bcl-6基因在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及意义

目的探讨CD68、cyclin D1蛋白表达及bcl-6基因重排对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）预后的影响。方法选取105例有详细随访资料的DLBCL患者石蜡样本，应用免疫组织化学EnVision法进行CD3、CDl0、CD20、CD68、cyclinD1、bcl-6、MUM1、SOX-11免疫标记，根据Han’s分类方法将DLBCL分为生发中心B细胞型（GCB型）和非生发中心B细胞型（non．GCB型）；应用荧光原位杂交（FISH）技术检测bcl-6基因重排。应用统计软件分析CD68蛋白、cyclin D1蛋白、bcl-6基因、化疗方案及各临床因素与生存期之间的关系。分别以GCB型、non-GCB型免疫表型和CHOP、R-CHOP化疗方案分组，比较疗效差异。结果105例患者中GCB型19例（18．1％），non-GCB型86例（81．9％），CD68高表达18例（17．1％），cyclin D1高表达36例（34．3％）。bcl-6基因重排21例（21．9％），CD68高表达、cyclinD1高表达与bcl-6基因重排三者之间无相关关系（P〉0．05）；单因素分析发现年龄≤60岁、临床分期I～Ⅱ期、IPI评分0～2分、乳酸脱氢酶（LDH）〈245 IU／L、GCB型、R-CHOP治疗方案患者的预后较好（P〈0．05），性别、原发部位与预后无相关关系（P〉0．05）。CD68、cyclin D1高表达、bcl-6重排者预后不良（P〈0．05）；分层结果显示GCB型或non-GCB型CD68高表达对比同种免疫表型组都具有较差的预后，non-GCB型时cyclinD1高表达和bel．6基因重排的预后不佳（P〈0．01，P=0．02）；治疗方案分层分析得出，在使用CHOP方案治疗时，CD68、eyclinD1高表达预后较差（P〈0．05），R-CHOP方案时，CD68、cyclinD1高表达与总生存期的差异无统计学意义（P=0．428和0．168）。多因素COX模型分析显示CD68高表达（P=0．026）、cyelinD1高表达（P=0．003）及LDH高水平（P=0．005）为各自独立的预后不良因素。结论CD68、cyclinD1高表达和bel-6基因重排提示预后差，CD68、cyclinD1蛋白和bel-6基因可以作为与DLBCL患者预后指标。

肝癌HBV整合点附近Cyclin E1基因高表达的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)整合肝癌基因组位点附近基因表达调控的改变。方法先后应用Southern blot、基因组文库构建与杂交筛选技术,在1例肝癌组织中克隆、筛选与鉴定了2个HBV DNA在人基因组中的阳性整合克隆,并对全长序列进行了测序分析。采用Western blot方法检测病毒插入点附近基因Cyclin E1的表达。免疫组化方法检测Cyclin E1在由143例肝癌组织构成的组织芯片中的表达水平。结果肝癌组织中有2条>3.2kb的阳性杂交带,分别为4.5kb和12kb,并有2个不同的整合位点。测序分析表明,其中一个病毒整合点的两端均位于人染色体19q12,插入的片段长度为1108bp,整合过程造成了2107bp HBV DNA缺失。另一个病毒序列整合到染色体的5p13,插入的病毒序列长度为2587bp,发生了基因重排。病毒插入位点附近Cyclin E1基因呈高表达。51.7%(74/143例)肝癌组织Cyclin E1表达阳性。结论 HBV DNA插入人基因组可能导致细胞Cyclin E1高表达,提示病毒整合人染色体的潜在致癌机制。