肝细胞癌患者中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1的表达及意义

目的 研究肝细胞癌(HCC)组织中细胞周期素依赖激酶2相关性Culin结构域1(CAC1)、细胞周期蛋白B2(CCNB2)、细胞周期蛋白Y(Cyclin Y)及细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)的表达,探讨四者的临床意义。方法 应用R语言分析癌症基因组图谱数据库中HCC癌和癌旁组织中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA的表达。免疫组化检测诊治的84例HCC癌组织及癌旁组织中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表达。Pearson相关分析癌组织中各指标表达的相关性。统计学分析HCC癌组织中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1表达与临床病理参数的关系。Kaplan-Meier生存分析(Log-rank检验)分析CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1表达与HCC患者生存预后的关系。结果 TCGA数据库HCC癌组织中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA的表达显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果CAC1、CCNB2、Cyclin Y与Cyclin E1 mRNA表达均呈正相关(P<0.05)。癌组织中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)。HCC患者不同肿瘤TNM分期及肿瘤数目的癌组织中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。84例患者随访2~60个月,随访期间死亡39例,失访2例,5年总体生存率52.44%(43/82)。CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1阳性表达组的5年总体生存率分别低于阴性表达组患者(P<0.05)。结论 HCC中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1表达升高,四者表达与肿瘤TNM分期及肿瘤数目有关,有助于判断HCC患者的生存预后。

FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的影响

【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR检测cyclinD1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH(0—100 ng.mL-1)均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),在FSH浓度为50 ng.mL-1时两种基因的表达量最大(P<0.05);FSH(50 ng.mL-1)也以时间依赖的方式促进了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),在作用30 min时其表达量达到高峰(P<0.05)。不同浓度的Foskolin(0—20μmol.L-1)均可以促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),但均低于FSH单独作用时两种基因的表达量;Rp-cAMP(0—40μmol.L-1)、H-89(0—30μmol.L-1)和Verapamil(0—100μg.mL-1)以剂量依赖的方式抑制了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),而且Rp-cAMP和Verapamil联合作用对FSH的抑制效果高于单独的抑制效果(P<0.05),但低于两者之和。此外,不同浓度的U0126(0—10μmol.L-1)降低了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),而Rp-cAMP、H-89、Verapamil和U0126单独作用时,cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达与对照相比没有显著差异(P>0.05)。【结论】FSH以剂量依赖和时间依赖的方式诱导了cyclin D1 mRNA和cyclinE1 mRNA的表达;cAMP-PKA、Ca2+和ERK1/2参与了FSH对cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的调节。

Cyclin E1在评估乙肝后肝硬化患者肝纤维化水平及肝细胞癌发生风险中的作用研究

目的探讨细胞周期素E1(CyclinE1)在评估乙型肝炎(乙肝)后肝硬化患者肝纤维化水平及肝细胞癌(HCC)发生风险中的作用。方法通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测2012年9月至2015年1月该院收治的73例乙肝后肝硬化患者血清CyclinE1水平。结合临床数据及随访资料,通过统计学方法分析CyclinE1水平与患者肝脏功能、肝纤维化程度、是否罹患HCC及生存时间的相关性。结果乙肝后肝硬化患者血清CyclinE1水平与Child-Pugh分级无相关性(P>0.05),但与自终末期肝病模型(MELD)评分呈线性相关(P<0.001),且与肝脏炎症和纤维化(LIF)评分呈线性相关(P<0.001)。同时,CyclinE1水平(P=0.034)、LIF评分(P=0.049),MELD评分(P=0.035)及乙肝病毒DNA病毒载量(P=0.019)与HCC发生有一定相关性。低CyclinE1组患者的生存率优于高CyclinE1组,差异有统计学意义(P=0.034)。结论乙肝后肝硬化患者血清CyclinE1水平可作为评估患者肝脏功能、肝纤维化水平和预测HCC发生风险的指标,且与乙肝后肝硬化患者的生存时间具有相关性。

has-miR-497-5p靶向CCNE1对类风湿性关节炎滑膜细胞增殖的影响

目的 评价has-miR-497-5p对类风湿性关节炎滑膜细胞(HFLS-RA)增殖的影响。方法 利用miRDB、TargetMiner、TargetScan和miRTarBase数据库预测has-miR-497-5p的作用靶基因,然后利用DAVID数据库对靶基因进行GO分析和KEGG信号通路富集,String数据库对靶基因进行互作分析;以HFLS-RA为研究对象,MTT检测has-miR-497-5p对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测has-miR-497-5p对细胞周期的影响;利用qRT-PCR检测has-miR-497-5p对HFLS-RA细胞CCNE1、CCND1、CCND2和CDK6 mRNA的影响;MTT评价has-miR-497-5p在沉默CCNE1后对细胞增殖的影响。结果 生物信息学预测has-miR-497-5p的靶基因共计125个,生物学过程主要集中于胸腺发育、蛋白质磷酸化、细胞凋亡和细胞周期等方面;信号途径主要富集于癌症相关的microRNA、PI3K-Akt途径和细胞周期等;细胞周期中的富集蛋白互作分析显示,CCNE1、CCND1、CCND2和CDK6之间存在相互作用;has-miR-497-5p过表达可以显著抑制细胞增殖(P<0.05),明显抑制细胞周期的S期(P<0.05);qRT-PCR结果显示,has-miR-497-5p模拟剂可以显著降低CCNE1、CCND1、CCND2和CDK6 mRNA表达(P<0.05);沉默CCNE1显著抑制细胞增殖(P<0.05)。结论 has-miR-497-5p可能通过靶向CCNE1抑制HFLS-RA增殖。

转染细胞周期蛋白E1对人脑神经胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨人脑神经胶质瘤U251的细胞活性与细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)表达的关系.方法pEGFPTimp1-Cyclin E1质粒体外转染上调U251细胞中Cyclin E1表达为Cyclin E1转染组,pEGFP-Timp1空载体质粒转染U251细胞为阴性对照组,常规培养U251细胞为空白对照组,荧光显微镜下观察并鉴定.CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;RT-PCR检测Cyclin E1 mRNA表达水平;Western blot检测Cyclin E1、p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平.结果Cyclin E1转染组Cyclin E1 mRNA和蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).U251细胞培养12、24 h时增殖水平在3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);培养48、72、96 h时,与阴性对照组和空白对照组比较,U251细胞增殖水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05).Cyclin E1转染组的迁移细胞数为(528.05±51.83)个,明显多于阴性对照组(131.73±35.09)个、空白对照组(129.58±32.14)个,差异具有统计学意义(P<0.01).Cyclin E1转染组p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.01);阴性对照组与空白对照组p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05).结论Cyclin E1表达上调能够明显增强人脑神经胶质瘤U251细胞的增殖和迁移能力,可能与激活PI3K/Akt信号通路有关.

miR-497靶向细胞周期蛋白E1抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖

目的研究miR-497在宫颈癌HeLa细胞中对细胞周期蛋白E1(CCNE1)的靶向作用及其对HeLa细胞增殖的影响。方法构建pre-miR-497、CCNE1野生型(WT-CCNE1)和突变型(MT-CCNE1)真核表达载体,采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)验证pre-miR-497载体的有效性,采用MTT法检测miR-497对HeLa细胞增殖的影响,采用双萤光素酶报告系统、qRT-PCR和Western blot法验证miR-497对CCNE1的靶向关系。结果测序结果提示pcDNATM6.2-GW-pre-miR-497、pmirGLO-CCNE1野生型和突变型表达载体构建成功,qRT-PCR证明转染pre-miR-497的HeLa细胞miR-497的表达显著升高。MTT法结果显示转染pre-miR-497的HeLa细胞增殖活性显著低于阴性对照miR组(P<0.05)。此外,双萤光素酶法检测共转染pre-miR-497和WT-CCNE1的HeLa细胞,其萤光素酶活性显著低于对照组(P<0.01),qRT-PCR及Western blot法也分别证实转染pre-miR-497的HeLa细胞其CCNE1的mRNA和蛋白水平显著下调(P<0.05)。结论 miR-497能够通过靶向CCNE1调控宫颈癌HeLa细胞的增殖活性。

细胞周期蛋白E1基因表达上调与胃癌发生的关系

目的在基因和蛋白水平检测胃癌组织中细胞周期蛋白E1(CCNE1)的表达,研究其与临床病理参数的相关性,探讨其与胃癌发生发展之间的关系。方法通过Oncomine(肿瘤微阵列数据库)分析CCNE1在胃癌中的表达。采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术检测34例配对样本中CCNE1的mRNA的表达水平。采用组织芯片/组织微阵列技术结合免疫组化方法检测CCNE1在34例配对样本中的蛋白表达情况。结果胃癌原发灶CCNE1 mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(P=0.001),在胃癌组织中CCNE1 mRNA表达水平在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期均呈现显著上调(P=0.042,P=0.016)。在胃癌原发组织中CCNE1蛋白阳性表达率[41.2%(14/34)]显著高于癌旁正常组织[0(0/34)]及胃炎组织[0(0/34)],P<0.01。CCNE1蛋白表达水平在不同分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移肿瘤的表达不同,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CCNE1表达上调可能与胃癌的发生、发展密切相关,提示CCNE1的检测可能为胃癌的诊断和预后提供参考。

miR-497 CCNE1在非小细胞肺癌组织中的表达及与预后的关系

目的:探讨微小RNA-497(miR-497)、细胞周期蛋白E1(CCNE1)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达特点,分析其与临床病理特征以及患者预后的关系。方法:选择2016年2月至2017年12月我院收治的102例NSCLC患者,选取手术切除的癌组织(NSCLC组)及癌旁组织(距肿瘤组织边缘≥5cm)(癌旁组)标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-497、CCNE1表达,Pearson相关性分析miR-497、CCNE1间相关性。分析miR-497、CCNE1与患者临床病理特征关系。术后保持随访,采用Kaplan-Meier法分析不同miR-497、CCNE1表达患者生存率差异,采用Cox比例风险模型分析影响NSCLC患者预后的相关因素。结果:NSCLC组miR-497表达低于癌旁组(P<0.001),CCNE1表达高于癌旁组(P<0.001)。miR-497、CCNE1表达与肿瘤直径、分化程度、TNM分期有关(P<0.001)。Pearson相关性分析结果显示miR-497表达与CCNE1呈负相关(r=-0.539,P<0.001)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示miR-497低表达组PFS生存率、OS生存率低于miR-497高表达组(P<0.05),CCNE1高表达组PFS生存率、OS生存率低于CCNE1低表达组(P<0.05)。Cox比例风险回归分析显示TNM分期Ⅲ期、miR-497<0.56、CCNE1≥1.05是NSCLC患者不良预后的危险因素(P<0.01)。结论:NSCLC组织中miR-497表达下调,CCNE1表达上调,miR-497可能通过负向调控CCNE1表达参与NSCLC恶性生物学行为以及不良预后的发生。

miRNA-25对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖的影响

目的:探讨过表达/沉默微小RNA-25(microRNA-25,miRNA-25)对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖能力的影响及其作用机制。方法:RT-PCR检测各临床样品组织中miRNA-25的表达水平。建立miRNA-25过表达/沉默的TE1细胞株,采用CCK-8法、Brd U实验和流式细胞术检测TE1细胞增殖能力的变化及细胞周期状态;Western blot法和RT-PCR法检测细胞周期调控因子细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的蛋白与mRNA表达水平。结果:miRNA-25在食管黏膜组织中具有特异性表达并在TE1细胞中呈高表达。CCK-8法和Brd U实验结果显示过表达miRNA-25的TE1细胞的增殖能力显著增加(P<0.05),而沉默miRNA-25抑制TE1细胞的增殖;流式细胞术检测结果显示过表达miRNA-25可明显促进TE1细胞从G0/G1期向S期转换,沉默miRNA-25则抑制其转换。同时Western blot和RT-PCR实验结果显示过表达miRNA-25后,cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表达水平均显著增加(P<0.05),沉默miRNA-25后则显著减少(P<0.05)。结论:miRNA-25能够促进人食管鳞状细胞癌细胞株TE1的增殖,其作用机制可能与促进细胞周期转换及上调cyclin E1和CDK2的表达水平有关,提示miRNA-25可作为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在靶点。

shRNA表达载体介导的细胞周期蛋白E1基因沉默对肾癌ACHN细胞生长的抑制作用

背景与目的:肾细胞癌中细胞周期蛋白E1(cyclinE1)的过表达与预后密切相关。为进一步验证其作为肿瘤基因治疗新靶点的可行性,本研究探讨shRNA表达载体介导的cyclinE1基因沉默对肾癌ACHN细胞生长的抑制作用。方法:针对cyclinE1基因设计并合成特定的RNA干扰模板片段,连接到pGenesil-1-U6载体上构建shRNA真核表达载体;将上述重组载体经脂质体转入ACHN肾癌细胞株。RT-PCR、Western印迹分析cyclinE1基因mRNA及蛋白表达抑制率;MTT比色法绘制细胞生长曲线;流式细胞术测细胞周期和凋亡细胞比率;Transwell小室体外侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力。结果:shRNA重组载体介导肾癌ACHNcyclinE1抑制效果显著(0.09±0.05),显著低于空载体对照组(0.88±0.04)及未转染组(0.90±0.03)(P<0.05)。经流式细胞术测得转染重组质粒组细胞生长停滞于G1期且凋亡比率显著升高(11.15±4.00)%(P<0.05)。生长曲线结果显示重组载体转染组细胞生长明显缓慢(P<0.05)。Transwell及迁移实验结果提示,转染重组质粒组细胞侵袭和迁移能力显著下降(P<0.05)。结论:肾癌cyclinE1的表达可被载体介导诱发的RNA干扰所成功抑制,进而导致细胞生长、增殖以及侵袭能力受抑并诱导凋亡;本研究为探讨肾癌的RNAi治疗提供了初步实验依据。

细胞周期蛋白E1基因在卵巢癌诊治中的作用

肿瘤细胞中基因拷贝数变异可影响细胞稳态,导致细胞恶变。细胞周期蛋白E1基因(CCNE1)编码细胞周期蛋白E1(Cyclin E1),CCNE1扩增或过表达改变Cyclin E1的表达,并影响其他基因的表达,参与多种恶性肿瘤的发生、发展。CCNE1扩增或过表达与卵巢癌的发生、耐药、靶向治疗及预后密切相关。该文综述CCNE1表达在卵巢癌诊治中的作用,以期有助于探寻新的卵巢癌治疗方法。

过表达miR-497靶向细胞周期蛋白E1抑制肺癌A549细胞的上皮间质转化

目的:探讨过表达miR-497靶向细胞周期蛋白E1(cyclin E1,CCNE1)对肺癌A549细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的影响。方法:常规培养人肺癌A549细胞,细胞实验分为正常组(不加干预)、对照组(转染miR-497 mimics-NC)、实验组(转染miR-497 mimics)。采用Transwell小室实验、免疫荧光染色、qPCR、Western blotting法分别检测各组细胞迁移和侵袭能力、蛋白间质标志物α-SMA和上皮标志物E-cadherin的表达、miR-497和CCNE1的表达水平,荧光素酶基因基因报告实验验证miR-497和CCNE1的靶向关系。结果:与对照组和正常组相比,实验组A549细胞迁移和侵袭的数量明显减少(均P<0.05),细胞的间质标志物α-SMA的绿色荧光强度明显减弱[(36.95±5.81)vs(98.69±2.36)、(97.94±2.63),均P<0.05],上皮标志物E-cadherin的绿色荧光强度明显增强[(388.41±10.93)vs(100.95±6.37)、(102.55±3.18),均P<0.05],miR-497的表达明显升高(均P<0.05),CCNE1的表达均明显下降(均P<0.05)。miR-497能够靶向调控CCNE1的表达。结论:在肺癌A549细胞中miR-497能够靶向调控CCNE1的表达,上调miR-497的表达后能明显抑制A549细胞迁移和侵袭能力,影响EMT相关蛋白的表达。

葡萄糖6-磷酸脱氢酶调控细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白依赖性激酶2促进细胞增殖及其在肾透明细胞癌中的预后价值

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一种转移率高、预后差的细胞代谢性疾病,对其有效诊疗及预后分子标志物的研究十分重要。葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase,G6PD)在ccRCC中高表达,并提示患者不良预后,其促进ccRCC细胞增殖的分子机制有待进一步揭示。本研究发现,降低G6PD可抑制细胞周期G_(1)/S期转化并显著抑制ccRCC细胞增殖。G6PD可在细胞水平调控G_(1)/S期转化及增殖相关因子Cyclin D1,CDK4,CDK6,Cyclin E1和CDK2基因表达。TCGA数据库分析结果表明,ccRCC中Cyclin D1,Cyclin E1和CDK2的mRNA水平显著升高,而CDK4表达无明显差异,CDK6表达却显著降低。相关性分析结果显示,G6PD与Cyclin D1呈显著负相关(P<0.0001),G6PD与CDK4,CDK6之间无显著相关性(P>0.05),G6PD与Cyclin E1(P<0.0001)以及CDK2(P<0.05)显著正相关。进一步免疫组化检测结果表明,Cyclin E1和CDK2在ccRCC肿瘤组织中表达显著升高。生存预后分析结果显示,Cyclin D1高表达提示ccRCC患者整体预后更为良好,CDK4和CDK6表达水平在ccRCC患者总生存率预测中无意义;而Cyclin E1和CDK2高表达均可提示ccRCC患者预后不良。进一步细胞水平检测发现,Cyclin E1、CDK2表达降低可显著逆转G6PD促进ccRCC细胞增殖的能力。综上,与增殖相关因子Cyclin D1,CDK4和CDK6相比,G6PD有可能通过促进Cyclin E1和CDK2表达升高而发挥促进ccRCC肿瘤细胞增殖的作用,并且这3者的异常高表达有望成为ccRCC患者不良预后的独立生存预测因素。

细胞周期蛋白E1基因rs1406(G/T)位点多态性与肝细胞癌高发家系遗传易感性的相关性

目的探讨细胞周期蛋白E1(CCNE1)基因rs1406(G/T)位点多态性与肝细胞癌高发家系遗传易感性的关系。方法选择2003年1月至2011年10月广西扶绥县壮族肝细胞癌高发地区20个肝细胞癌家系,包括肝细胞癌患者20例(A组)及其直系亲属59例(B组);另选10个生活在同一地区的正常家系(共40例)作为对照(C组)。各家系均符合Hardy-Weinberg遗传平衡,具有人群代表性。利用质谱方法检测CCNE1基因rs1406(G/T)位点基因型分布频率;采用PLINK软件分析各家系人群基因型分布频率差异。结果CCNE1基因rs1406(G/T)位点存在GG、TT、GT 3种基因型。A组GG基因型3例,TT基因型3例,GT基因型14例;B组GG基因型14例,TT基因型14例,GT基因型31例;C组GG基因型23例,TT基因型2例,GT基因型15例。A组与B组人群CCNE1 rs1406(G/T)位点上G、T分布频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。A+B组与C组人群rs1406(G/T)等位基因G、T分布频率比较差异有统计学意义(比值比=3.639,95%可信区间:1.533~8.637,P<0.05)。结论CCNE1基因rs1406(T)为广西扶绥县壮族人群肝细胞癌发生的风险基因型。

Cdkn1b基因、FOXE1基因多态性与甲状腺乳头状癌易感性的相关性研究进展

细胞周期依赖性激酶阻滞基因1B(CDKN1B,cyclin-dependent kinase inhibitor 1B)又称p27KIP1,在细胞周期中,阻滞细胞从G1期进入S期,被认为是抑癌基因。叉头框E1(FOXE1,forkhead boxE1),又称甲状腺转录因子2,是近年来全基因组关联研究发现的与甲状腺乳头状癌密切相关的遗传位点。目前甲状腺乳头状癌的研究越来越多,基因与基因、基因与环境因素的交互作用对甲状腺癌发病影响也日益受到关注。现从两基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系进行综述,以期为甲状腺乳头状癌的易感性以及预防提供新的思路。

硼替佐米联合PLK1抑制剂处理肿瘤细胞A549、HeLa对其增殖影响

目的明确硼替佐米(bortezomib,PS341)和PLK1抑制剂处理肿瘤细胞HeLa、A549后细胞增殖的变化,探索不同药物组合使用的抗肿瘤作用机制。方法CCK-8法检测不同浓度分组的药物处理A549、HeLa细胞后的生长曲线;采用PI染色法检测PLK1抑制剂BI2536、GW843682X与蛋白酶体抑制剂PS341的合并使用对肿瘤细胞周期的影响;采用Western blot检测细胞周期相关蛋白和PLK1的蛋白表达水平。结果PLK1抑制剂BI2536、GW843682X均明显抑制A549、HeLa细胞生长并使其阻滞在G_(2)/M期,加入蛋白酶体抑制剂PS341后细胞增殖抑制被削弱、G_(2)/M期阻滞的细胞减少、周期蛋白cyclin E1异常积累。结论PS341可明显减弱PLK1抑制剂的细胞增殖抑制效果,认为PLK1抑制剂与PS341联合使用需考虑药效减弱的风险,推测相关分子机制涉及细胞周期蛋白代谢异常。

靶向人CyclinE1基因RNA干扰真核表达载体的构建及筛选

目的 构建编码细胞周期蛋白（Cyclin）E1 mRNA的短发卡样RNA（shRNA）质粒表达载体,筛选出沉默效果可靠shRNA表达载体.方法 Genebank查出CyclinE1 mRNA编码区,以454～472及708～726位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,分别构建2个shRNA质粒表达载体和1个无关序列作为阴性对照,shRNA两端设计有BamHⅠ及HindⅢ双酶切位点,中间含Sal Ⅰ酶切位点,与含BamH Ⅰ及HindⅢ双酶切位点的空质粒载体连接,重组质粒经聚合酶链反应（PCR）酶切电泳及测序鉴定.质粒转染细胞后经逆转录（RT）-PCR及Western blot检测Cyclin E1 mRNA及蛋白沉默效果.结果 构建重组质粒经Sal Ⅰ酶切后扩增形成条带与理论值一致,插入片段cDNA经测序同基因文库相符.Cyclin E1 mRNA表达率在正常对照组（ACHN）、阴性质粒转染组（pGenesil-HK）分别为：0.91±0.04、0.87±0.02,明显高于稳定转染pGenesil-Cyclin E1-shRNA1组及pGenesil-Cyclin E1-shRNA2组的0.11±0.01和0.16±0.03（P＜0.05）.前两组Cyclin E1蛋白表达分别为：0.89±0.07、0.84±0.03,也显著高于后两组的0.10±0.06和0.14±0.04（P＜0.05）.结论 针对人Cyclin E1基因的shRNA质粒真核表达载体pGenesil-Cyclin E1-shRNA1构建成功且沉默效果满意.

老年皮肤血管瘤特征及microRNA调节的机制研究

目的从microRNA水平上寻找影响血管瘤血管发生的因素,并结合其下游蛋白的表达情况分析其与血管瘤发生的相关性。方法收集老年血管瘤,血管肉瘤等各种血管异常的标本,HE染色组织学观察;实时PCR分析microRNA表达;免疫组织化学检测α-SMA和IV型胶原;免疫荧光检测MEK-1、CYCLIN-E1同CD34共同表达的情况。原位杂交法检测microRNA-96。培养血管内皮细胞株并转染MEK-1和CYCLIN-E1 siRNAs验证蛋白表达的趋势。结果 microRNA PCR分析表明老年血管瘤组织microRNA-96水平比其他血管异常组织低。microRNA-96目的基因MEK-1和CYCLIN-E1蛋白表达较正常皮肤和其他血管异常组织增加。转染MEK-1和CYCLIN-E1的siRNA后,内皮细胞数量下降。结论老年血管瘤microRNA-96表达的减少和MEK-1、CYCLIN-E1水平的增加可以导致细胞异常增殖。

雌二醇通过雌激素受体α/糖原合酶激酶-3β/β联蛋白信号通路调节成骨细胞增殖

目的研究观察雌二醇对小鼠成骨细胞前体细胞增殖影响并研究经典wnt通路在其增殖过程中的作用。方法本研究利用小鼠胚胎成骨细胞前体细胞Mc3T3-E1为细胞模型,不同浓度雌二醇处理Mc3T3-E1细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖率,蛋白印迹法和免疫荧光技术检测经典Wnt信号通路信号分子表达。结果研究表明不同浓度雌二醇处理Mc3T3-E1细胞,MTT显示随着雌二醇浓度增加,Mc3T3-E1细胞增殖率增加,其中以10-7 mol/L浓度处理后细胞获得最佳增殖率。蛋白印迹法结果显示随着雌激素浓度增加,小鼠Mc3T3-E1细胞中p-GSK-3β,β联蛋白(catenin),细胞周期蛋白(Cyclin)D1的表达增加。经雌激素受体(ER)α沉默后,相对于空白对照组小鼠Mc3T3-E1细胞p-GSK-3β,β-catenin及Cyclin D1表达下降,而ERβ沉默后,同对照组相比成骨细胞中各分子表达则无明显变化。结论雌二醇可通过ERα/GSK-3β/β-catenin信号通路调节小鼠成骨细胞增殖。

前列腺素E_1对血小板功能的影响和临床应用研究

源于二高-γ-亚麻油脂酸,由磷脂酶A_2活化限速的体内强大内源性扩血管物质前列腺素E_1（PGE_1）的扩血管作用和抑制血小板活性作用仅次于前列环素,并与前列环素存在部分共同受体,主要在肺内产生、肺内代谢。目前发现外源性PGE_1可抑制疾病状态下过度活化的血小板活性,如某些心血管疾病、肾脏疾病、糖尿病都伴有不同特点的血小板活性增加及血管内皮或肾系膜细胞的异常,并有内源性扩血管前列腺素生成减少或效应减低,因而补充外源性前列腺素E_1可能有益。