CDK5对胃癌PD-L1表达及生物学特性的影响

目的通过大数据挖掘与实验相结合,探讨CDK5对胃癌PD-L1表达及生物学特性的影响。方法通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载胃癌FPKM数据,通过R软件及其相关软件包依次进行CDK5与PD-L1表达及其相关性分析、CDK5高低表达分组的差异基因的基因本体(GO)和京都基因和基因组数据库(KEGG)通路富集分析,以及CDK5与免疫检查点、免疫细胞间相关性等生物信息学分析;通过CCK-8、Transwell、实时PCR、Western blotting、流式细胞术等检测CDK5抑制剂20-223对胃癌BGC-823细胞增殖、迁移、PD-L1表达、细胞周期及凋亡等的影响。结果通过大数据发现CDK5在多种癌症中均高表达;CDK5与PD-L1在胃癌中高表达,且呈正相关。CDK5抑制剂抑制CDK5后,胃癌BGC-823细胞PD-L1蛋白的表达下降(P=0.0134),PD-L1 mRNA表达水平也下降(P=0.0004);过表达CDK5上调PD-L1 mRNA表达(P=0.0059)。CDK5抑制剂可显著抑制IFN-γ促进的PD-L1转录(P<0.0001)。抑制CDK5后,细胞周期阻滞于G2/M期;细胞凋亡增加,40μmol/L组总凋亡细胞比例高于对照组(P=0.0377),80μmol/L组总凋亡较40μmol/L组进一步增加(P=0.0005);细胞迁移减少,Transwell实验结果显示,CDK5抑制剂组细胞穿过数量明显低于对照组(P=0.0025);划痕实验结果显示,CDK5抑制剂组迁移率明显低于对照组(4.39%vs 24.37%,P=0.0026)。CDK5抑制剂浓度0.04μmol/L组细胞克隆形成能力明显低于对照组(克隆形成率32.60%vs 80.87%,P=0.0004)。结论CDK5与PD-L1在胃癌中均高表达且呈正相关。CDK5通过IFN-γ通路促进胃癌BGC-823细胞PD-L1表达。CDK5抑制剂可促进胃癌细胞凋亡,抑制细胞周期、细胞迁移能力及克隆形成能力。

CCNL1真核表达载体的构建及其在MDA-MB-231细胞中表达的鉴定

目的:构建pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAXⅠ-CCNL1和pEGFP-C1-CCNL1三组重组载体,鉴定其在MDA-MB-231细胞中的表达情况。方法:用PCR方法扩增得到CCNL-1基因,然后用EcoRⅠ、HindⅢ酶切CCNL1基因,将其分别与pcDNA3.1(+)、pVAXⅠ和pEGFP-C1载体连接,构建pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAXⅠ-CCNL1和pEGFP-C1-CCNL1三组重组载体,然后用Fugene HD转染试剂将构建的真核表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,48h后,用荧光定量PCR和Western blotting方法检测CCNL1在MDA-MB-231细胞中的差异表达。结果:转染MDA-MB-231细胞48h后,在荧光显微镜下,pEGFP-C1-CCNL1重组载体能观测到绿色荧光,而pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAXⅠ-CCNL1重组载体未观测到;在MDA-MB-231细胞中CCNL1的mRNA和蛋白质表达水平由高到低依次为pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAXⅠ-CCNL1和pEGFP-C1-CCNL1。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAXI-CCNL1和pEGFP-C1-CCN1三组重组载体,且pcDNA3.1(+)-CCNL1在MDA-MB-231细胞中高表达。

P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白检测在宫颈鳞状上皮内病变诊断中的应用

目的初步探讨P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白检测在宫颈鳞状上皮内病变诊断中的应用价值。方法选择在温州市人民医院就诊患者,收集69例宫颈鳞状上皮内病变标本,行P16^(INK4A)、HPV L1壳蛋白检测,分析P16^(INK4A)、HPV L1壳蛋白及P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白在各级宫颈病变中的表达差异。结果 P16^(INK4A)在LSIL组、HSIL组、SCC组中的阳性率分别为45.5%、85.2%、100.0%。同LSIL组比较,P16INK4A在HSIL组及SCC组阳性率明显升高(P<0.01)。HPV L1壳蛋白在LSIL组、HSIL组、SCC组中的阳性率分别为63.6%、18.5%、0%,HPV L1壳蛋白在LSIL组中阳性率明显低于HSIL组及SCC组(P<0.01)。随着宫颈病变加重,P16+/L1-阳性率有升高趋势(P<0.01),P16-/L1+阳性率有下降趋势(P<0.01)。LSIL组中P16+/L1-阳性率明显低于HSIL组和SCC组(P<0.01),SCC组P16+/L1-阳性率较HSIL组有明显提高(P<0.05)。LSIL组中P16-/L1+阳性率明显低于HSIL组和SCC组(P<0.01)。P16+/L1-较P16^(INK4)、HPV L1壳蛋白单一检测筛查HSIL+特异性明显升高(P<0.01)。结论 P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白有望成为诊断宫颈鳞状上皮内病变的有效指标。

细胞周期蛋白L1对人绒毛膜滋养细胞生物学行为的影响

目的探讨细胞周期蛋白L1(CCNL1)对人绒毛膜滋养细胞生物学行为的影响及调控机制。方法以人绒毛膜滋养细胞HTR⁃8/SVneo为模型,根据转染的类型分为CCNL1过表达组,过表达对照组,CCNL1干扰组1,CCNL1干扰组2,CCNL1干扰组3,干扰对照组,采用实时荧光定量(qPCR)及Western Blot方法检测CCNL1 mRNA和蛋白水平的表达变化;CCK⁃8法检测增殖能力;Transwell方法检测细胞侵袭、迁移能力;流式技术检测细胞周期和凋亡情况。结果过表达CCNL1后,滋养层细胞的迁移、侵袭能力降低(P<0.05);增殖能力降低(P<0.05);细胞周期S期的细胞数减少(P<0.05)。干扰CCNL1后,滋养层细胞的迁移、侵袭能力增强(P<0.05);增殖能力增强(P<0.05)。结论CCNL1基因可能通过调控滋养层细胞的迁移、侵袭以及增殖能力而影响胎盘的功能。

替米沙坦对3T3－L1脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ信号通路的影响

目的观察替米沙坦对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号通路的影响，探讨替米沙坦延缓2型糖尿病病程的作用机制。方法诱导3T3-L1前脂肪细胞至80%成熟（对照组），加入50 ng/ml肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激1 h（TNF-α组），分别以0.1、5、10 μmol/L替米沙坦加入培养基干预24 h，即T0.1, T5和T10组。应用Western印迹检测PPARγ及其磷酸化水平、细胞周期依赖性蛋白激酶5（CDK5）表达变化；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测培养基中脂联素含量。短发夹RNA（shRNA）沉默未分化3T3-L1的PPARγ，筛选PPARγ丝氨酸突变型3T3-L1细胞系即S273A、S112A、S186A，以进一步确定磷酸化位点。shRNA沉默CDK5，油红O染色、异丙醇萃取检测分化效率，以10 μmol/L替米沙坦干预成熟3T3-L1，Western印迹检测pPPARγ/PPARγ，ELISA检测培养基脂联素含量。结果TNF-α刺激及替米沙坦干预后各组CDK5表达差异均无统计学意义（均P〉0.05）。与TNF-α组相比，T5组、T10组pPPARγ/PPARγ降低，脂联素含量增加，差异均有统计学意义（均P〈0.05），T0.1组差异均无统计学意义（均P〉0.05）。与3T3-L1野生型（WT）相比，S186A、S112A组加入TNF-α后pPPARγ/PPARγ升高，脂联素降低，加入替米沙坦后pPPARγ/PPARγ降低，脂联素含量增加，差异均有统计学意义（均P〈0.05），S273A组pPPARγ/PPARγ、脂联素差异均无统计学意义（均P〉0.05）。异丙醇萃取显示沉默CDK5组（shCDK5）与随机对照（shCon）组相比3T3-L1分化差异无统计学意义（P〉0.05），Western印迹显示与shCDK5组相比，shCon组加入替米沙坦后pPPARγ/PPARγ降低，脂联素增加，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论替米沙坦能够缓解因TNF-α刺激导致的PPARγ磷酸化水平升高，上调脂联素含量。CDK5介导了替米沙坦对3T3-L1脂肪细胞PPARγ信号通路的影响。替米沙坦的作用位点为PPARγ第273位丝氨酸，PPARγ第273位丝氨酸上游激酶为CDK5。

microRNA-199b-5p在尤文肉瘤细胞系中的功能研究

目的探讨microRNA-199b-5p(mi R-199b-5p)在尤文肉瘤细胞系中的功能,分析其作用机制,以期为临床生物学治疗提供理论依据。方法取人尤文肉瘤细胞系A673、TC252,分别以mi R-199b-5p寡核苷酸片段(mimic)及其阴性对照(mimic control)转染,作为实验组及对照组。实时荧光定量PCR检测mi R-199b-5p m RNA相对表达量,并与MSCs比较;细胞计数试剂盒8法检测mi R-199b-5p对细胞增殖的影响;流式细胞术法检测对细胞周期及凋亡的影响。双荧光报告基因实验初步检测mi R-199b-5p可能作用的靶基因,Western blot验证靶基因。结果实时荧光定量PCR检测示,对照组A673细胞及TC252细胞中的mi R-199b-5p m RNA相对表达量与MSCs相比均显著下降(P<0.05),与实验组对应细胞相比亦显著下降(P<0.05)。与对照组对应细胞相比,实验组处于G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,比较差异均有统计学意义(P<0.05);而两组G2/M期细胞无明显差异(P>0.05)。实验组细胞凋亡率与对照组对应细胞相比显著增高(P<0.05)。双荧光报告基因实验检测mi R-199b-5p可能作用的靶基因是细胞周期调节蛋白1(cyclin-L1,CCNL1)和c-Kit。Western blot检测显示,与对照组对应细胞相比,实验组CCNL1和c-Kit蛋白相对表达量明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 mi R-199b-5p能抑制尤文肉瘤细胞增殖,阻滞细胞周期转换,促进细胞凋亡,其抑制作用是通过靶向CCNL1和c-Kit实现的。

替米沙坦在细胞周期依赖性蛋白激酶5介导的过氧化物酶体增殖物激活受体γ磷酸化调节脂联素表达中的作用

目的研究替米沙坦在细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK）5介导的过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ磷酸化水平上升、调节3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的机制。方法诱导至转化率达到80%的3T3-L1脂肪细胞以不同浓度肿瘤坏死因子（TNF）-α（10、50、100 ng/ml，分别为T10、T50、T100组）刺激1h，T100组以替米沙坦不同剂量（0.1、5、10 μmol/L，分别为Tel0.1、Tel5、Tel10组）干预24 h后利用Western blotting法检测CDK5、p35蛋白表达水平和PPARγ磷酸化水平；实时荧光定量聚合酶链反应检测CDK5、p35、PPARγ mRNA表达变化；酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测培养基上清脂联素释放变化。构建并包装携带p35基因的逆转录病毒感染3T3-L1细胞，以空载体病毒为对照，同时设置CDK5抑制剂组，检测CDK5、p35/p25、磷酸化PPARγ（pPPARγ）及脂联素表达。实验数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。结果与未处理组相比，T10、T50、T100组CDK5 mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义（均P〉0.05）；T50、T100组p35 mRNA（2.11±0.66、2.71±0.59比1.22±0.35；q=3.77、4.91）及蛋白（0.32±0.02、0.45±0.04比0.09±0.01；q=2.19、4.55）相对表达量显著上升（均P〈0.05）；各组PPARγ mRNA及蛋白相对表达量差异均无统计学意义（均P〉0.05），T50、T100组pPPARγ/PPARγ显著上升（0.21±0.03、0.47±0.04比0.11±0.02；q=3.89、6.91），脂联素释放显著下降（1.56±0.34、1.07±0.12比2.36±0.55；q=6.32、6.99，均P〈0.05）；替米沙坦干预后，与T100组相比，各组CDK5、p35 mRNA及蛋白相对表达量差异均无统计学意义（均P〉0.05）；Tel5、Tel10组pPPARγ/PPARγ显著降低（0.11±0.03、0.05±0.01比0.38±0.02；q=4.91、5.22），脂联素释放显著上升（1.71±0.26、1.92±0.17比1.11±0.05；q=5.77、6.43，均P〈0.05）；过表达p35可检出p25表达，同时显著上调pPPARγ/PPARγ（0.87±0.12比0.07±0.02，q=9.13）并下调脂联素释放（1.39±0.12比2.21±0.33，q=5.67），抑制剂组pPPARγ/PPARγ下降（0.15±0.01比0.87±0.12，q=3.14），脂联素释放上升（1.95±0.24比1.39±0.12，q=4.99），差异均具有统计学意义（均P〈0.05）。结论替米沙坦能够抑制CDK5过度激活导致的PPARγ磷酸化，调节3T3-L1脂肪细胞脂联素表达。