鱼类病毒(SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV)LAMP联检方法的建立和应用

建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒3(CyHV-3)、鲤鱼浮肿病毒(CEV)和病毒性神经坏死病病毒(VNNV)等4种鱼类常见病毒的环介导等温扩增技术(LAMP)联合检测方法。基于4种鱼类病毒的基因保守区分别设计LAMP引物组,优化反应体系和条件,筛选测试出特异性和灵敏度最佳的引物组,建立4种鱼类常见病毒的联合检测LAMP方法,同时以市售的荧光定量检测试剂盒测试结果作为对照,评估建立的联合检测LAMP方法的准确性。结果显示,筛选出的SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的LAMP引物组特异性均良好,优化后的体系反应条件均为63℃,60 min,其中SVCV和CyHV-3均可检测到10 fg/μL,CEV和VNNV可检测到1 fg/μL。应用建立的4种病毒联合LAMP检测方法和市售的各荧光定量PCR检测试剂盒对150份收集的组织样本进行平行测试,联合LAMP检测方法的准确率为100%。建立的鱼类病毒LAMP联检方法能够准确、高效、快速地在鱼类组织样本中同时对SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV进行检测,适合水产养殖现场检测,对病毒的监测和快速诊疗起到重要作用。

基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将p ORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短ORF65(truncated ORF65)插入p ET32a(+)载体,构建了p ET32a-trun ORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、Bepi Pred 1.0软件预测了p ORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入p ET32a(+)载体,构建了p ET32a-mod ORF65。重组质粒分别转入BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,p ET32a-mod ORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 k D。此外,利用r Protein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清Ig M,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的p ORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测p EGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。

鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大小与预期一致,约为35 kD,且主要分布在包涵体中。Western blot分析显示,免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞;间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞。ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础。

鲤疱疹病毒3型T分离株主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定鲤疱疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3,CyHV-3)主要免疫原性蛋白,研究采用CyHV-3-T分离株感染CCB细胞系,运用蔗糖密度梯度超速离心方法对CyHV-3进行纯化,纯化的病毒颗粒经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色后,用锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)抗CyHV-3阳性血清进行Western blotting分析和液相色谱串联质谱鉴定。结果表明,透射电镜下可观察到大量完整囊膜包裹或只有裸露核衣壳的CyHV-3颗粒,Western blotting结果显示抗CyHV-3阳性血清与多种病毒蛋白具有明显特异性免疫反应,质谱鉴定表明其中4种免疫原性蛋白分别为ORF92、ORF66、ORF72和ORF81,其中ORF66和ORF72为首次鉴定的具有免疫原性衣壳蛋白。本研究将为CyHV-3血清学诊断方法的建立、亚单位疫苗或DNA疫苗的研制提供更多候选抗原。

鲤疱疹病毒3型焦磷酸测序检测方法的建立

为了针对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3)建立一种基于焦磷酸测序技术的高通量、自动化、快速的检测方法,根据Cy HV-3 ORF55、ORF79和ORF92基因保守区域设计特异性PCR扩增引物和测序引物,进行PCR扩增筛选扩增效率最高的引物。PCR灵敏性和特异性试验结果显示,针对ORF79设计的引物扩增效率最高,最低检测量为100个拷贝数,且能特异性识别Cy HV-3;将PCR产物进行焦磷酸测序,获得的序列经BLAST比对显示与Cy HV-3-U、I、J和GZ11分离株一致性均为100%。该检测方法方便快速,适用于出入境口岸大批量样品Cy HV-3诊断检测。

锦鲤疱疹病毒ORF134基因的克隆与表达

以感染锦鲤疱疹病毒的患病鱼为材料,通过RT-PCR克隆ORF134的编码序列,在细胞水平分析其表达模式,并在原核表达系统中表达,获得可溶性的ORF134重组蛋白。结果表明ORF134在锦鲤疱疹病毒裂解感染中转录,证实ORF134为非结构功能基因。ORF134全长为624 bp,含有1个内含子,编码179个氨基酸,序列分析显示ORF134同已报道的高等脊椎动物病毒编码的vIL-10具有较低的序列同源性,但具有较高的结构相似性。体外表达分析显示ORF134呈分泌性表达,但不能形成寡聚体,与其他病毒编码的vIL-10具有差异。进一步通过原核表达获得可溶性的ORF134重组蛋白。

鲤疱疹病毒3型ORF57基因工程亚单位疫苗制备及免疫保护研究

旨在研究鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)囊膜蛋白ORF57作为疫苗候选抗原的可能性。根据已经发表的鲤疱疹病毒3型全基因组(GenBank登录号为DQ657948.1),设计特异性引物,扩增、克隆ORF57序列并进行生物信息学分析。构建重组原核表达载体pET-32a(+)-CyHV-3-ORF57,大肠埃希菌体外表达获得重组蛋白ORF57。此外,对ORF57亚单位疫苗的免疫保护性进行研究。鲤鱼免疫4周后CyHV-3攻毒具有75%的存活率,ORF57亚单位疫苗组鲤鱼的存活率显著高于PBS和pET-32a(+)组。实验结果证明,重组ORF57亚单位疫苗具有较强的免疫保护性,为免疫学临床的应用和CyHV-3疫苗的开发提供了实验基础。

基于鲤疱疹病毒3型ORF65基因的DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护研究

为开发针对鲤疱疹病毒3 型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)[又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)]的DNA 疫苗,该研究将CyHV-3 ORF65 插入pEGFP-N1,构建pEGFP-ORF65 重组质粒,通过转染实验与活体成像实验证实pORF65-EGFP 融合蛋白可以在建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)体外、体内表达;重组质粒按照3 μg·尾^-1 的剂量尾柄肌肉注射免疫10 g 左右的建鲤鱼苗,免疫3 次,ELISA 检测表明pEGFP-ORF65 免疫后可以显著提高血清特异性抗体水平;攻毒实验显示,CyHV-3 攻毒21 d 后,PBS 组、pEGFP-N1 组和pEGFPORF65组的建鲤成活率分别为25%、30%和90%,攻毒建鲤的成活率显著提高(P<0.01)。该研究为ORF65 作为DNA 疫苗靶基因应用于CyHV-3 的防控提供了依据。

黑龙江地区鲤疱疹病毒3型的流行病学调查及其主要囊膜蛋白的抗原表位预测

2015-2016年对来自黑龙江地区46个养殖场送检的鲤鱼进行锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)的分离鉴定,并应用DNAStar等软件对检出的阳性样本的主要囊膜蛋白(Major envelop protein,MEP)基因进行生物信息学分析。结果显示,KHV的检出率约为6.5%,3株阳性样本具有相同的MEP基因序列,称之为KHV-HLJ1516。MEP基因开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸,相对分子质量为28 280.58,等电点为8.40。对KHV-HLJ1516的MEP基因序列同源性分析表明,其与KHV-GZ11分离株仅有1个碱基不同,但并未导致氨基酸发生改变,碱基相似性为99%;而与HZ419分离株相比,KHV-HLJ1516的MEP基因有3个碱基发生突变,相应的氨基酸由Asn变为IIe。聚类分析结果显示,KHV-HLJ1516与KHV-GZ11处于同一分支,而HZ419位于另一分支。B细胞抗原表位预测结果显示,KHV-HLJ1516的MEP的抗原表位主要位于4~11,24~40,42~63,82~110,209~218,238~249氨基酸区段。

镜鲤抗疱疹病毒(CyHV-3)F_(4)抗病品系病毒表达量评估

以镜鲤抗疱疹病毒新品种F_(4)为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术以TK(thymidine kinase)和ORF72基因为病毒标志基因,分析镜鲤抗疱疹病毒(CyHV-3)选育抗病品系F_(4)在病毒感染不同阶段中的表达量。结果显示:2个基因不同感染阶段脾、肾组织表达量趋势一致,24~144 h呈上升趋势,144~288 h呈下降趋势,且在144 h时脾、肾组织的病毒表达量均达到最高。脾组织2个基因表达量均低于肾组织。选育组2个基因在120 h均达到差异极显著,未选育组2个基因均在96~144 h差异极显著。选育组2个基因表达量低于未选育组。脾、肾组织TK基因均在96~168 h差异极显著;脾、肾组织ORF72基因均在96~192 h差异极显著,其中脾组织216 h也差异极显著。以上结果说明选育组抗病性能强于未选育组,其中肾组织抗病性能强于脾组织,且经选育肾组织抗病免疫性能得到提高。目前,未见其他鱼类的选育种在抗病性状上达到一个稳定阶段,对于病毒表达量的研究可为其他鱼类的研究提供重要的参考作用。

鲤疱疹病毒3型研究进展

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)是引起高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)的病原,该病毒自1997年首次报道以来,在全球多个国家传播、流行,范围覆盖亚洲、欧洲、北美及非洲多个国家,给鲤鱼及锦鲤养殖业造成无可估量的经济损失。本文就鲤疱疹病毒3型的病原学、流行病学、感染机制、诊断及防控等方面的研究进行简要综述,以期为鲤疱疹病毒3型基础研究和疾病防控策略的建立提供参考信息。

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致鲤大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学观察,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB),盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球状,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。

温度对锦鲤疱疹病毒体外培养和致病性的影响

【目的】证实温度对锦鲤疱疹病毒CyHV-3体外增殖和致病性的影响。【方法】选用CyHV-3-EGFP病毒株为研究对象,采用间接免疫荧光染色法测定病毒滴度,使用荧光显微镜观察病毒体外增殖,研究病毒的热稳定性、以及温度对病毒的体外培养和体内致病性的影响。【结果】CyHV-3在4~36℃条件下具有很好的稳定性,温度超过36℃后,病毒活力随着温度升高而降低,50℃时病毒活力完全丧失。感染温度对CyHV-3病毒活力影响不大,高温(37℃)和低温(4℃)时病毒都具有感染能力。但是,孵育温度明显影响病毒活力,温度高于30℃时,CyHV-3的增殖能力减退甚至消失。鲤鱼感染CyHV-3病毒后,低温组(15℃)的死亡率为26.67%,常温组(25℃)的死亡率为73.33%,高温组(30℃)和对照组的死亡率均为0。【结论】证实了CyHV-3病毒在低温下能够增殖并且具有致病性,解释了近年来锦鲤疱疹病毒(KHVD)的暴发及流行不再受限于春秋季节的现象。

锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布

【目的】研究锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)感染鲤鱼的侵染规律与动态病理损伤,为CyHV-3致病机理的研究奠定实验基础,同时为有效防控锦鲤疱疹病毒病提供参考。【方法】采用浸泡法对鲤鱼进行人工感染试验,于不同时间点剖检采样,进行动态病理学观察和荧光定量PCR检测,选择具有代表性的外部(鳃)和内部器官(肾脏)进行动态病理学观察。【结果】鳃小片呼吸上皮细胞增生严重并伴有大量炎症细胞浸润,肾脏主要表现为间质性肾炎,肾小管上皮细胞变性坏死。试验鱼在感染前期病毒含量最高的是鳃组织,肠道中未检测到病毒,随着感染时间的延长,各组织内的病毒含量逐步增加。病毒感染10 d后,鳃、肾脏以及脑组织的病毒含量达到最高值,随后病毒量保持稳定。脾脏、肝脏和肠道中病毒含量的最高值出现在感染第14天。【结论】CyHV-3在鲤鱼体内先入侵鳃组织,随后到达肾脏、脾脏等全身各组织器官中。