泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞MAPK信号通路5个相关基因的影响

目的探讨泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路5个相关基因的影响。方法采用大鼠肝星状细胞株HSC-T6与不同蛋白浓度的泡球蚴囊液(0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7、3.4、6.8和13.5 mg/ml)共培养24 h后收集细胞,同时收集对照组(未加泡球蚴囊液干预)细胞,显微镜下观察HSC-T6细胞的形态变化。利用荧光实时定量PCR检测大鼠肝星状细胞的细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和丝裂原活化蛋白激酶(p38)的表达情况。结果蛋白浓度为13.5 mg/ml泡球蚴囊液与HSC-T6细胞共培养24 h后,大部分细胞发生固缩,呈脱落前兆。6.8 mg/ml囊液组部分细胞固缩,呈脱落前兆;而部分HSC-T6细胞收缩,呈长梭形,细胞生长出许多细长的伪足,是正常状态的2倍以上。3.4 mg/ml囊液组部分细胞呈收缩的长梭形,生长出许多细长的伪足,但大部分细胞仍呈现为贴壁的胞体较大的不规则多边形,且伸出较短的伪足与其他细胞连接成片状。<1.7 mg/ml囊液组与对照组细胞形态上无差异。实时荧光定量PCR检测显示,泡球蚴囊液浓度>0.4 mg/ml时,ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA水平显著增加;囊液浓度为6.8 mg/ml时,ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA较对照组高表达(P<0.05)。结论浓度为6.8 mg/ml的泡球蚴囊液可显著影响大鼠肝星状细胞ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA水平。

不同培养基与饲养细胞组合对多房棘球绦虫体外培养模型的影响

背景:多房棘球绦虫原头节的体外成囊培养是提取与研究其生发层干细胞的实验基础。D-MEM与RPMI-1640是最适宜用于泡球蚴体外培养的商业培养基,HeLa细胞与大鼠肝癌细胞(ATCC No. CRL-1600)也是常用饲养细胞。目的:构建多房棘球绦虫体外培养模型,观察泡球蚴在不同饲养细胞[HeLa细胞与大鼠肝癌细胞(ATCC No.CRL-1600)]及含有体积分数10%胎牛血清的不同培养基[D-MEM(高/低糖型)与RPMI-1640]下生长情况。方法:预先培养HeLa细胞及大鼠肝癌细胞(ATCC No.CRL-1600),从新疆石河子大学第一附属院实验动物中心提供的感染多房棘球绦虫6个月以上的种鼠体内提取原头节后分别与不同饲养细胞及培养基体外共同培养。实验经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准,批准号:2015-018-01,批准时间:2017-04-07。实验根据饲养细胞与培养基组合分为6组,每组加入1×10~6饲养细胞与50mL含体积分数10%胎牛血清的培养基及5000个原头节,Ⅰ组:HeLa细胞与1640培养基培养;Ⅱ组:HeLa细胞与D-MEM(高糖型)培养基培养;Ⅲ组:大鼠肝癌细胞与1640培养基培养;Ⅳ组:大鼠肝癌细胞与D-MEM(高糖型)培养基培养;Ⅴ组:HeLa细胞与D-MEM(低糖型)培养基培养;Ⅵ组:大鼠肝癌细胞与D-MEM(低糖型)培养基培养,观察泡球蚴原头节的生存、生长和发育,每隔7d计算原头蚴成囊率,使用目镜测微尺测量囊泡平均直径大小。结果与结论:①原头蚴在6种组合中均可长期存活,大部分都形成囊泡,囊泡直径分布在1-6 mm;②培养第56天原头蚴成囊率和囊泡平均直径均为大鼠肝癌细胞与D-MEM(高糖型)培养基组效果最佳(P <0.05),成囊率(72.08±1.79)%,囊泡平均直径(3.379±0.199) mm;③囊泡囊液蛋白定量检测结果显示6组囊液蛋白含量均低于体内囊泡,Ⅳ组蛋白含量高于其他5组(P <0.05);④结果证实:同条件下D-MEM(高糖型)培养基囊泡大小与数量优于其他2种培养基。大鼠肝癌细胞(ATCC No.CRL-1600)作为饲养细胞囊泡大小与数量优于HeLa细胞。D-MEM(高糖型)与大鼠肝癌细胞(ATCC No.CRL-1600)共同作用的环境下原头蚴生长发育的成囊率及囊泡大小最佳,可作为体外培养泡球蚴原头蚴获得囊泡的最优选择。

包虫囊液干预的肝细胞Foxp3与IFITM3表达变化及其与干扰素刺激蛋白相关性分析

目的观察包虫囊液干预的肝细胞核转录因子Foxp3、干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达变化并分析其与干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。方法从包虫病羊肝脏包囊中抽取囊液,将人肝癌细胞HepG2分为高浓度组、中浓度组、低浓度组及对照组,分别加入1∶10、1∶100和1∶1000浓度比例的囊液及不加囊液,采用Western blotting法及荧光定量PCR法检测各组干预后及低浓度组在干预后0、12、24、36、48、60、72 h细胞中的Foxp3、IFITM3及相关干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白及mRNA表达,采用Spearman分析Foxp3、IFITM3与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。结果不同囊液浓度干预下,IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3、ISG15蛋白及mRNA表达随着干预囊液浓度降低逐渐升高,IFIT3蛋白表达中浓度组>低浓度组、高浓度组(P均<0.05),IFIT3 mRNA高、中、低浓度组差异无统计学意义。低囊液浓度干预下各时点IFITM1、IFITM2、IFIT3蛋白表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、ISG15蛋白表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3蛋白表达随囊液干预时间延长而升高;IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、IFITM1 mRNA表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3 mRNA表达随囊液干预时间延长而升高。Spearman相关分析结果显示,不同囊液浓度干预下Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关(P=0.004);Foxp3 mRNA、IFITM3蛋白及mRNA表达与IFITM1、IFITM2、ISG15 mRNA表达均呈正相关(P均<0.05),与IFIT3 mRNA表达无相关性;Foxp3蛋白表达与IFITM1、ISG15蛋白表达呈正相关(P均<0.05),与IFITM2和IFIT3蛋白表达无相关性。低囊液浓度干预下各时点Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关(P均<0.05);Foxp3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈负相关;IFITM3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈正相关(P均<0.05)。结论在低浓度包虫囊液干预下,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3及ISG15表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关;随着囊液干预时间的延长,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFIT3、ISG15表达降低、Foxp3的表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关。

兔豆状囊尾蚴囊液蛋白的纯化与抗原性鉴定

为了找出抗原性强、免疫原性好的兔豆状囊尾蚴抗原蛋白，本研究对兔豆状囊尾蚴的头节、体节和囊膜等结构性抗原与囊液中代谢性抗原进行了比较，发现囊液代谢性抗原的免疫效果优于结构性抗原。通过SDS-PAGE和微孔超滤分离法对囊液蛋白进行纯化，再用纯化的蛋白免疫小鼠，制备高免血清，并对免疫鼠的免疫器官进行病理学和免疫组织化学检查。结果证明用从囊液中纯化的63000蛋白免疫效果最好。用纯化的63000蛋白免疫小鼠可获得高效价抗血清，小鼠免疫器官活化，巨噬细胞、滤泡树突细胞、淋巴细胞和浆细胞等各种免疫细胞增多，用免疫组织化学染色，免疫器官中的CD4、CD8T细胞和CD20B细胞呈强阳性反应。总之，从囊液中分离纯化的63000蛋白抗原性强、免疫原性，可用于对豆状囊尾蚴痛的免疫学诊断。

细粒棘球蚴囊液蛋白对卵清蛋白诱导的小鼠变应性鼻炎效果

目的观察细粒棘球蚴囊液蛋白(hydatid cyst fluid protein,HCFP)对卵清蛋白(ovalbumin,OVA)诱导的小鼠变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的保护作用。方法将24只BALB/c小鼠(8~10周龄,体质量约20 g)随机分成A(空白对照组)、B(空白干预组)、C(AR模型组)、D(AR+HCFP干预组)4组,每组6只。在基础致敏阶段(实验第0、2、4、6、8、10、12天),A、B、C、D组小鼠分别腹腔注射200μL无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),含20μg HCFP的无菌PBS溶液,含50μg OVA和5 mg Al(OH)3凝胶的无菌PBS溶液,含50μg OVA、5 mg Al(OH)3凝胶和20μg HCFP的无菌PBS溶液。在局部激发阶段(实验第14~20天),A、B、C、D组小鼠分别鼻腔滴注体积为40μL的无菌PBS、含20μg HCFP的无菌PBS、含2 mg OVA的无菌PBS、含2 mg OVA和20μL HCFP的无菌PBS。观察各组小鼠行为学改变并进行行为学评分,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组小鼠血清γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)、IL-5、IL-10、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和OVA特异性IgE抗体(OVA-sIgE)水平,采用苏木精-伊红(HE)染色观察各组小鼠鼻黏膜病理学改变。结果C组小鼠行为学评分[(6.83±0.50)分]显著高于A组[(1.17±0.52)分]和B组[(1.33±0.52)分],D组小鼠行为学评分[(3.50±0.50)分]较C组降低(P均<0.05)。4组小鼠血清IFN-γ(F=4.08,P<0.05)、IL-4(F=275.90,P<0.05)、IL-5(F=96.82,P<0.05)、IL-10(F=77.67,P<0.05)、TGF-β(F=9.98,P<0.05)及OVA-sIgE水平(F=44.69,P<0.05)差异均有统计学意义。C组小鼠血清IFN-γ水平低于A、B组和C组,且血清IL-4、IL-5、OVA-sIgE水平均高于A、B组和C组(P均<0.05);D组小鼠血清IL-10、TGF-β水平高于C组(P均<0.05)。镜下观察显示,C组小鼠鼻黏膜纤毛脱落缺损明显,杯状细胞数量增多且体积增大,间质水肿,黏膜下见小血管扩张;D组小鼠鼻黏膜病变较C组轻。结论HCFP对OVA诱导的小鼠AR具有保护效果。

诊断兔豆状囊尾蚴病的阻断ELISA方法的建立和初步应用

为了提高对兔豆状囊尾蚴病的血清学诊断率,本研究用纯化的63 000囊液蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了高效价一抗,再用63 000囊液蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG为二抗,通过对各种试验条件的优化,建立了特异诊断兔豆状囊尾蚴病的阻断ELISA方法。结果显示,63 000囊液蛋白最佳包被浓度是5mg/L;一抗最佳稀释度为1∶800;最佳封闭时间是37℃3h;二抗最佳稀释度为1∶5 000,最佳反应时间是37℃30min;底物显色5min,终止反应后可先用目测法进行初步判定,并立即用酶标仪检测,根据D450值和判定标准确诊。用新建的阻断ELISA方法对兔的常见病,如兔脑炎原虫病、兔瘟、兔巴氏杆菌病、兔球虫病和弓形虫病进行了检测,均无交叉反应。从屠宰场和感染兔场随机采集150份血清样品,分别用阻断ELISA方法和间接血凝试验（IHA）进行比较检测,证明阻断ELISA方法的诊断率明显高于IHA。总之,阻断ELISA方法是一种简便、快速、灵敏和准确诊断兔豆状囊尾蚴病的新方法,适宜于基层兽医工作者应用和推广。