地塞米松可增强支气管哮喘小鼠肺组织RECK的表达

目的研究Kazal基序逆向诱导富含半胱氨酸蛋白(RECK)在支气管哮喘小鼠肺组织的表达及地塞米松处理后对其表达的影响。方法 BALB/c小鼠分为哮喘组、对照组、地塞米松组,每组10只。采用鸡卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏及雾化吸入的方法制作哮喘模型,进行支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(EOS)及淋巴细胞(Lym)分类计数;HE染色观察气道炎症细胞浸润及气道重塑情况,实时荧光定量PCR检测RECK mRNA的表达,免疫组织化学法检测RECK蛋白的表达及定位。结果与对照组和地塞米松组相比,哮喘组BALF中细胞总数、EOS明显增多;RECK mRNA在哮喘组表达较对照组、地塞米松组明显降低。免疫组织化学结果显示RECK主要表达于气道上皮细胞、上皮下炎症细胞。哮喘组表达最低,对照组表达最高,地塞米松组表达较哮喘组有所增高。结论 RECK在哮喘小鼠肺组织中表达明显降低,而地塞米松可上调RECK的表达。

姜黄素对鼻咽癌细胞系CNE-1RECK基因表达及甲基化的影响

目的 探讨姜黄素对鼻咽癌细胞RECK基因表达及甲基化的影响，并探讨可能的机制。方法 体外培养鼻咽癌细胞系CNE-1，用1，10和30μmol/L 姜黄素处理后，用Western blot和实时定量PCR分别检测RECK基因以及DNA甲基化酶1（DNMT1）蛋白和mRNA表达；高效液相色谱-电喷雾质谱检测RECK甲基化，同时用MTT检测CNE-1细胞增殖，EMSA法检测核转录因子Sp1的DNA结合活性。结果 CNE-1细胞未刺激时RECK表达水平较低，而经1-30μmol/L 姜黄素处理后，能显著增强RECK蛋白和mRNA的表达（P〈0.05）。30μmol/L 姜黄素处理CNE-1细胞后， RECK启动子甲基化水平降低至31% （P〈0.05），全基因组甲基化水平降低39% （P〈0.05），细胞核的甲基化活性减少了71.6% （P〈0.05）。同时，姜黄素能显著降低CNE-1细胞中DNMT1蛋白和mRNA表达 （P〈0.05），也能减低CNE-1细胞的存活率 （P〈0.05）。此外， EMSA结果显示，姜黄素处理后，CNE-1细胞中Sp1的DNA活性显著降低。结论 姜黄素可能通过能上调RECK基因表达，降低细胞内甲基化水平，从而可能发挥对CNE-1细胞生长。

生物信息学分析miR-221/26a、lncRNA GAS5和RECK mRNA在结直肠癌转移中的作用

目的基于生物信息学筛选结直肠癌转移相关的mRNA、miRNA及lncRNA,分析其在结直肠癌转移中的作用。方法通过生物信息学方法筛选出与结直肠癌转移相关的mRNA、miRNA及lncRNA,采用荧光定量PCR(qPCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测筛选出的miR-221/26a、lncRNA GAS5和回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元(RECK)mRNA在结直肠癌组织中的表达;构建lncRNA GAS5过表达和沉默细胞株验证miRNA、lncRNA和RECK相互关系。结果软件预测结果显示miR-221/26a可以跟RECK mRNA结合,lncRNA GAS5可同时结合miR-221/26a;qPCR结果显示miR-221/26a在结直肠癌组织中的表达高于相应的癌旁组织(P<0.001、或0.05),而lncRNA GAS5在结直肠癌中表达水平降低(P<0.001);成功构建GAS5过表达和沉默细胞株后,结果显示过表达GAS5时miR-221/26a含量下降(P<0.011,或<0.05),RECK蛋白含量降低;而沉默GAS5会上调miR-221/26a含量(P<0.05),促进RECK蛋白表达。结论miR-221/26a与lncRNA GAS5在结肠癌肿瘤组织均存在异常表达,并可能影响RECK蛋白表达进而影响结直肠癌肿瘤的转移。

非小细胞肺癌组织中RECK蛋白的表达及与预后的关系

目的探讨非小细胞肺癌组织中RECK的表达及其与预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测RECK在48例肺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,通过Kaplan-Meier生存曲线法比较阳性组和阴性组患者的预后情况。结果肺癌组织中RECK表达阳性率为29.2%(14/48),在癌旁正常肺组织中阳性表达率为85.7%(42/48),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。RECK的表达与淋巴结转移和TNM分期有关,而与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学分化程度无关。与无淋巴结转移和Ⅰ、Ⅱ期的肺癌组织相比,在有淋巴结转移和Ⅲ期的肺癌组织中,RECK的阳性表达显著性降低(P<0.05)。RECK蛋白阴性组的患者的生存期较阳性组短,统计学上有显著性差异(P=0.018)。结论RECK蛋白在肺癌中具有低表达,在肺癌的侵袭和转移中发挥重要作用,并与肺癌患者的预后相关。

幽门螺旋杆菌感染对胃上皮细胞RECK基因的影响

目的研究幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori,Hp)感染对胃上皮细胞(GES-1)RECK基因启动子区域的甲基化以及mRNA表达水平的影响,并探讨其可能的致癌机制。方法用培养的Hp感染GES-1细胞0～144h。采用甲基化特异性聚合酶链式反应法检测RECK基因启动子区域的甲基化情况;逆转录PCR检测RECK基因mRNA水平;Westernblot检测核转录因子(NF-κB)的激活情况,并观察用NF-κB特异性抑制剂PDTC处理后的RECK的mRNA水平。结果 Hp感染GES-1细胞0～72h不能诱导RECK基因甲基化,感染96h后GES-1细胞内出现了明显的RECK基因甲基化,同时能降低RECK基因mRNA水平。Hp感染24h后能激活其NF-κB,24～72hNF-κB活性水平无明显改变。感染96h后NF-κB的活性有所增强,NF-κB特异性抑制剂PDTC能上调RECK基因的表达。结论 Hp感染通过诱导RECK基因启动子区域的甲基化,促进NF-κB激活,降低RECK基因的表达,这可能是Hp致胃癌的可能机制之一。

淋巴道转移舌鳞癌细胞RECK、MMP-2和MMP-9表达的动物实验研究

目的在动物模型水平探讨RECK表达水平与MMP-2和MMP-9的关系。方法采用爪垫注射Tca8113细胞建立舌鳞癌淋巴道转移裸鼠模型,收集4周后回流淋巴结,采用免疫组化、Western blot方法检测RECK、MMP-2、MMP-9水平。结果8例舌癌淋巴结转移模型裸鼠均有MMP-2、9表达,细胞染色呈较强的阳性,而RECK未发现较强阳性细胞出现,只有可疑的阳性细胞散在出现;淋巴结转移的舌癌细胞RECK表达明显低于用于移植的Tca8113舌癌细胞(t=7.78,P<0.01);MMP-2、9表达水平均显著高于用于移植的舌癌细胞(t分别为3.06,2.25,P<0.01或0.05)。结论动物体内实验进一步证实RECK低水平表达可增加舌癌侵袭转移机率,其调控机理可能与RECK抑制MMP-2、9表达有关。

miR-181c通过靶向抑制RECK促进人A549细胞的迁移及微血管形成

目的探讨miR-181c对肺癌细胞迁移及微血管形成的影响。方法利用癌症转录组数据分析网站UALCAN分析TCGA数据库中肺癌miR-181c和带有Kazal基序的反向诱导带有Kazal基序的反向诱导富含半胱氨酸蛋白(RECK)基因表达,miRNA靶基因预测网站Targetscan预测其靶向关系;将miR-181c模拟物、抑制物及阴性对照物转染至A549细胞,实时定量PCR检测RECK mRNA的表达,Western blot法检测RECK、基质金属蛋白酶2(MMP2)和MMP9蛋白表达;TranswellTM检测细胞迁移能力;ELISA检测培养液中血管内皮生长因子A(VEGF-A)的分泌,用培养上清液处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC),体外小管形成实验检测微血管形成;双荧光报告基因实验验证miR-181c与RECK基因的直接靶向关系。结果相对于正常组织,肺癌组织中miR-181c显著高表达,而RECK显著低表达;Targetscan预测表明miR-181c在RECK的3′非翻译区(3′-UTR)有结合域;miR-181c下调RECK的表达,而上调MMP2、MMP9的蛋白表达;促进A549细胞迁移和VEGF-A分泌,A549细胞培养上清液增强HUVEC分化成管的能力;双荧光报告基因实验证实RECK是miR-181c的直接作用靶点。结论miR-181c可直接靶向RECK促进人A549肺癌细胞的迁移及微血管形成。