牦牛CYGB基因CDS区克隆与生物信息学分析

【目的】丰富牦牛CYGB基因研究的基础数据,对牦牛CYGB基因的CDS区进行克隆和生物信息学分析。【方法】提取牦牛大脑海马区组织的总RNA并运用RT-PCR技术反转录为cDNA,并根据GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列(GenBank登录号:DV874786.1),使用Primer3.0在线软件设计特异性引物,运用PCR扩增技术、TA克隆技术和核酸测序技术获得CYGB基因的完整CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区,并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在线分析软件与Lasergene7.1软件包分析CYGB的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树;利用PyMol软件修饰并输出三维结构;使用在线亚细胞定位工具PSORT II Prediction预测蛋白质的亚细胞定位;使用Protfun软件对蛋白质的功能进行预测分析。【结果】克隆获得牦牛CYGB基因650 bp,包括CDS区573 bp(GenBank登录号:KF669898),碱基组成为A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%,编码190个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对,牦牛CYGB基因在CDS区存在4个碱基突变,同源性为99.3%,这个突变未导致氨基酸序列的改变,4个突变均属同义突变。牦牛CYGB基因编码蛋白的分子式为C964H1513N263O278S7,分子量约为21.5 kD,理论等电点(pI)为6.32,消光系数为24075,不稳定系数为48.43,疏水指数为83.63,平均亲水性为-0.301,属不稳定可溶性酸性蛋白质,在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,其中α-螺旋占64.21%,无规卷曲占35.79%,属全α类蛋白质。三级结构是一个呈"three-over-three"三明治夹心型的α-螺旋折叠结构。亚细胞定位CYGB分布在细胞质(65.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(13.0%)、分泌系统的囊泡(4.3%)中,主要在细胞质,推测可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列与普通牛、绵羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原鸡、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分别为100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致,说明CYGB基因编码区在进化过程中比较保守。【结论】通过RT-PCR与TA克隆技术及核酸测序技术获得了牦牛CYGB基因全长573 bp的CDS区,并对其核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列及其蛋白结构和功能进行了分析,得知牦牛的CYGB是一个由190个氨基酸残基构成的可溶酸性蛋白质,在能量代谢和辅因子生物合成过程中发挥重要作用。CYGB基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性。该基因的成功克隆及分析为揭示牦牛CYGB基因的遗传特性提供了理论依据。

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析,为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物,提取牦牛肝组织RNA,以反转录合成的cDNA为模版,克隆牦牛Cygb基因并进行测序,运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】牦牛Cygb基因编码区全长573bp,编码190个氨基酸,编码产物分子质量21.5ku,理论等电点为6.61。蛋白预测表明,Cygb编码蛋白整体表现为亲水性,蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明,11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,其中牦牛与牛的同源性最高,达到99.0%。【结论】克隆到573bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对照组,有统计学差异(P<0.01).流式细胞技术检测各组LO-2细胞凋亡情况结果显示,稳定表达细胞组的细胞凋亡百分比高于阴性对照组(P<0.05).结论:成功构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;建立稳定表达CYGB的人肝细胞株LO-2-GFP-CYGB以及阴性对照组细胞株LO-2-GFP;稳定表达CYGB的肝细胞生长速率较阴性对照组肝细胞降低,稳定表达CYGB的肝细胞凋亡百分比高于阴性对照组肝细胞;为CYGB与其蛋白的相互关系研究提供了细胞模型.

Overexpression of cytoglobin gene inhibits hypoxic injury to SH-SY5Y neuroblastoma cells

A plasmid for cytoglobin expression, pAcGFP1-Cl-cytoglobin, was transfected into SH-SY5Y cells. Cobalt chloride was used to establish a model of hypoxia. Western blotting indicated that cytoglobin was overexpressed and there was low expression of hypoxia-inducible factor-la in SH-SY5Y cells after transfection. Following cobalt chloride-induced hypoxia, cytoglobin and hypoxia-inducible fac- tor-la expression gradually increased in SH-SY5Y cells. Flow cytometry showed that with increas- ing duration of hypoxia, the proportion of normal cells significantly diminished in the transfected and non-transfected groups. The proportion of cells in the early stages of apoptosis increased. However, the proportion of apoptotic cells was significantly lower in the transfected group compared with the non-transfected group. These results demonstrate that cytoglobin and hypoxia-inducible factor-la are strongly up-regulated by hypoxia, and that there is a strong relationship between hy- poxia-inducible factor-la and cytoglobin during hypoxic injury.

甘南牦牛CYGB基因的克隆及生物信息学分析

【目的】探讨甘南牦牛CYGB基因的分子结构特征及生理功能。【方法】提取甘南牦牛血样基因组DNA,以其为模板PCR分段扩增后拼接得到CYGB基因,测序后进行生物信息学分析。【结果】克隆出甘南牦牛CYGB基因,其长度为8 484bp,含有4个外显子和3个内含子,外显子长度分别为143,232,164和34bp,内含子长度分别为5 175,280和2 379bp,可编码190个氨基酸残基,氨基酸编码存在明显的密码子偏倚现象。与普通牛相比较,甘南牦牛CYGB基因存在73处核苷酸变异位点,其中2处发生在外显子2区域,氨基酸序列未发生改变;71处发生在内含子区域。甘南牦牛CYGB拥有"three-over-three"类型的螺旋"三明治"折叠结构。系统发育树分析表明,甘南牦牛CYGB与黄牛、绵羊等物种之间存在较高的同源性。【结论】成功克隆了甘南牦牛CYGB基因,为进一步研究牦牛CYGB的遗传特性和生理机制奠定了基础。

甘南牦牛CYGB基因第4外显子的多态性分析

为研究甘南牦牛CYGB基因第4外显子的遗传多态性及变异特征,本实验采用PCR-SSCP方法检测了300头甘南牦牛的CYGB基因。结果显示,甘南牦牛CYGB基因第4外显子存在AA、AB和AC 3种基因型,其基因型频率分别为0.800、0.100和0.100,由A、B和C 3个等位基因控制。序列分析表明,甘南牦牛CYGB基因第4外显子3'UTR区的等位基因B处发生了A→C突变;在外显子4的第25bp的等位基因C处发生了A→G突变,但该突变发生并未引起氨基酸水平的变化。统计结果表明,甘南牦牛CYGB基因呈低度多态,该牦牛群体处于平衡状态。

CyGB和HMGB1对大鼠心搏骤停/复苏后的评价与意义

目的检测大鼠心搏骤停(CA)/心肺复苏(CPR)后胞红蛋白(CyGB)和高迁移率族蛋白Bl(HMGB1)分别在大脑海马回CA1区的表达及外周血清中的含量,以研究其对复苏后的评价及意义c方法90只健康SD大鼠,随机分为假手术(SO)组,CPR组及干预治疗(IVT)组,每组分3、12、24、48及72 h 5个观察时间点。窒息法制作大鼠CA/CPR模型。ELISA法测定血清CyGB和HMGB1的含量,采用TUNEL染色法检测海马回CA1区神经元的凋亡率,SABC法检测CyGB和HMGB1在海马回CA1区中的表达即平均光密度值(AOD)。结果海马回CA1区CPR组中的AOD:CyGB的表达在CPR后3 h明显降低,且随时间延长而增强,24 h达高峰,但48 h又降低;HMGB1的表达在3 h开始升高,CPR组分别与SO组和IVT组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。外周血清CPR组中:CyGB的含量变化与在海马回CA1区中的表达变化一致,呈正相关(r=0.883,P<0.01);HMGB1的含量与在海马回CA1区中的表达亦呈正相关(r=0.926,P<0.01),CPR组分别与SO组和IVT组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。海马回CA1区中神经元的凋亡率与HMGB1表达的AOD呈正相关(r=0.621,P<0.05)。结论CyGB与HMGB1在大脑的表达与在外周血清中的含量是一致的,其中HMGB1变化与神经元的凋亡是一致的;在大鼠CA/CPR后,CyGB有一定脑保护作用,HMGB1参与CA/CPR后损伤。因此,通过检测外周血清中CyGB和HMGB1含量对心肺脑复苏效果与预后可能有量化价值。

珠蛋白研究进展及其在法医学中的应用

珠蛋白是一类能够通过铁卟啉环可逆性结合氧的呼吸性蛋白质,目前在脊椎动物体内已有4种类型的珠蛋白被鉴定和正式命名:血红蛋白(haemoglobin,Hb),肌红蛋白(myoglobin,Mb),脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)和细胞珠蛋白(cytoglobin,Cygb),它们共同组成珠蛋白超家族(globin superfamily)。本文就珠蛋白的组织分布、结构特征、生物学功能及其在法医学中的应用等作一综述。

圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响

采用远紫外圆二色光谱法系统地研究了细胞红蛋白(cytoglobin,Cygb)的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对细胞红蛋白二级结构的影响。结果表明:当Cygb浓度<1μmol/L时,它主要以α-螺旋形式存在,其α-螺旋含量>60%;当Cygb浓度从0.3μmol/L增大到2.0μmol/L时,其α-螺旋含量迅速降低;当Cygb浓度>2.0μmol/L时,其α-螺旋含量随浓度的增大变化很小(约30%)。随着温度的升高,Cygb的α-螺旋含量逐渐减小,但既使温度达到368K,它仍保持有20%的α-螺旋结构,说明该蛋白具有较高的热稳定性。在弱酸性和弱碱性溶液中,Cygb的二级结构都会有不同程度的破坏。在甲醇和乙醇中,Cygb的α-螺旋含量明显增加,这说明醇类可以诱导其α-螺旋的生成。

培养心肌细胞缺氧时胞红蛋白表达变化特点

目的探讨心肌细胞缺氧后胞红蛋白表达变化的特点与规律。方法利用酶消化法及差速贴壁法分离培养新生2—3d大鼠的心肌细胞，分为4组：对照组，缺氧4、12、24h组。对照组置常规培养箱（5％CO，、95％空气，37℃）中培养，缺氧组置缺氧培养箱中培养（2％O2，5％CO2，93％N2，37℃），于不同时间（4、12、24h）后，取心肌细胞进行免疫组化染色和免疫印迹分析蛋白水平的分布与表达的变化，用逆转录PCR法分析胞红蛋白mRNA水平的变化。结果免疫组织化学染色显示胞红蛋白主要分布于细胞质，缺氧各组胞红蛋白染色强度均高于常氧组（对照组）。免疫印迹灰度分析结果显示，缺氧4h组胞红蛋白表达量高于常氧组，但差异无统计学意义（P〉0．05），而缺氧12、24h组胞红蛋白表达高于常氧组，差异有统计学意义（P〈0．05）。缺氧4、12、24h组胞红蛋白mRNA水平均高于常氧组（P〈0．05），缺氧12、24h组较缺氧4h组更进一步增高（P〈0．05）。结论胞红蛋白分布于心肌细胞的细胞质。培养心肌细胞缺氧4h后胞红蛋白转录增强，缺氧12h后蛋白水平增强。胞红蛋白表达增加可能是心肌细胞对缺氧的一种代偿反应。

重组人细胞红蛋白的表达纯化及谱学表征

以可溶性和包涵体两种形式表达纯化得到了重组人细胞红蛋白,并比较了其谱学特征和热稳定性.可溶性蛋白经硫酸铵分级沉淀,再依次经Hiprep 16/10 Q FF阴离子交换柱、Hiload16/60 Superdex75凝胶过滤柱和CM Sepharose FF阳离子交换柱纯化,得到电泳纯的包涵体蛋白;包涵体蛋白经盐酸胍变性溶解、外加血红素重组和柱层析得到了电泳纯的可溶性蛋白.电喷雾质谱表明,以这两种形式得到的蛋白分子量相差153.0,紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和圆二色光谱均表明,这两种形式的蛋白在血红素构象上存在差异,其热稳定性也不相同.

光谱法研究人胞红蛋白与铜(Ⅱ)离子的相互作用（英文）

胞红蛋白(Cygb)是近期在脊椎动物中发现的一种球蛋白家族成员,具有典型珠蛋白的"3+3"式的α-螺旋三明治折叠结构。利用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱及圆二色(CD)光谱法研究了Cu^(2+)离子与Cygb的相互作用。结果表明,当Cu^(2+)离子加入到Cygb溶液中后,Cygb在280nm处的紫外吸收强度增大,说明Cu^(2+)与Cygb发生了相互作用;Cu^(2+)使Cygb的内源性荧光发生猝灭,其猝灭方式为静态猝灭。同步荧光光谱研究表明,Cu^(2+)可使色氨酸和酪氨酸的微环境发生较小的改变,与酪氨酸相比Cu^(2+)对Cygb的键合部位更接近于色氨酸。圆二色光谱研究表明,Cu^(2+)对Cygb的二级结构未引起明显变化。

胞红蛋白对巨噬细胞氧化损伤的保护作用

目的探讨CYGB在巨噬细胞氧化损伤过程中的表达及作用。方法构建CYGB高表达/低表达巨噬细胞模型,Western blot检测不同浓度H_2O_2刺激RAW264.7 12 h后CYGB的蛋白表达水平;用分光光度计观察RAW264.7在氧化损伤过程中乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量的变化情况。结果 0.5 mmol/L H_2O_2处理巨噬细胞12 h后CYGB表达水平明显高于空白对照组(P<0.05);与0.5 mmol/L H_2O_2处理组相比,0.5 mmol/L H_2O_2对CYGB高表达组的CYGB表达升高(P<0.05),而0.5 mmol/L H_2O_2对CYGB低表达组的CYGB表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);0.5 mmol/L H_2O_2+CYGB高表达组中LDH活性和MDA含量下降;0.5 mmol/L H_2O_2+CYGB低表达组中LDH活性和MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论巨噬细胞氧化损伤时CYGB表达水平增加;CYGB在巨噬细胞氧化损伤过程中具有拮抗作用。

新型缺氧保护因子胞红蛋白的研究进展

作为珠蛋白家族的第四名成员,胞红蛋白在缺氧条件下的表达明显增强。其在生物体内分布广泛,具有多种重要的生物学功能,如抗氧化应激、抗纤维化、神经保护作用以及在心血管疾病、癌症等和缺氧有关的疾病中起到一定的保护作用。文中综合了近年来的研究成果,就胞红蛋白的结构与分布,抗纤维化、抗癌、促进肌肉再生等相关生理功能以及在缺氧下的表达调节和表达机制作一综述。

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).

藏羚羊脑组织胞红蛋白基因的表达

目的检测藏羚羊不同脑区脑组织胞红蛋白(CGB)基因的表达状况。方法选取藏羚羊海马、丘脑、小脑、额叶、顶叶、枕叶、颞叶、中脑组织,应用实时荧光定量RT-PCR技术检测CGB基因的表达、实时定量PCR相对定量比较CT法(2-△△CT法)分析结果。结果藏羚羊脑海马、丘脑、小脑、额叶、顶叶、枕叶、颞叶、中脑组织CGB基因的2-△△CT值分别为0.00、1.78、1.00、1.30、1.19、1.21、4.08、7.41。结论藏羚羊不同脑区脑组织CGB基因均有表达。藏羚羊脑组织CGB基因相对表达量由高到低依次为中脑、颞叶、丘脑、额叶、枕叶、顶叶、小脑和海马。

胞红蛋白酵母双杂交载体的构建与表达

胞红蛋白(CGB)是一种新发现的分布于胞浆与胞核的携氧珠蛋白。为探讨CGB在体内的相互作用蛋白,从而促进对其分子调控网络的认识,根据CGB基因的开放阅读框架设计并合成PCR引物,从人胎肝cDNA文库中扩增得到该基因编码区。测序分析正确后将其定向克隆到酵母表达载体pGBKT7中,构建获得CGB的酵母表达载体pGBKT7-CGB,并在酵母菌AH109中表达。提取酵母总蛋白并利用标签蛋白(myc)的抗体进行免疫印迹检测。结果表明所构建的CGB酵母表达载体能够在酵母中高效表达,可用于后续的酵母双杂交文库的筛选工作。

体外培养神经元缺氧时细胞红蛋白基因表达的变化

目的探讨体外培养神经元在缺氧时细胞红蛋白（cytoglobin,Cygb）基因表达的变化规律。方法运用无血清培养技术进行胎鼠皮质神经元培养6 d,用免疫组织化学方法进行纯度鉴定,随机分为4组,其中3个实验组分别置于0.5%～0.9% O2中8、16、24 h,对照组置于正常环境。用CCK8试剂盒测试细胞生存率,用Real-time PCR方法检测不同时点Cygb基因表达的情况。结果神经元纯度鉴定纯度〉99%;缺氧后神经元Cygb基因的表达随时间增长而递增。结论体外培养神经元缺氧时Cygb基因表达增强,提示Cygb可能在神经细胞缺氧时发挥重要作用。

胞红蛋白调控血管平滑肌表型转换与高血压血管重建机制研究

目的观察胞红蛋白调控血管平滑肌表型转换与高血压血管重建机制研究。方法选择我院实验中心饲养12周龄雄性SD大鼠30只,体质量(200±20)g。分为3组:肾动脉缩窄高血压药物组、肾动脉缩窄高血压组、正常对照组;高血压药物组大鼠用血管紧张素Ⅱ一型受体(AT1R)拮抗剂阿利沙坦酯灌胃,免疫荧光定量PCR法及免疫印迹检测Cygb表达水平,观察三组大鼠Anxa8、Tpm3、Retn1b mRNA基因表达变化;观察正常血压主动脉与高血压主动脉大鼠模型术后6周血管重建后Cygb mRNA表达水平。结果肾动脉缩窄高血压药物组、肾动脉缩窄高血压组的Anxa8、Tpm3基因表达显著高于正常对照组,Rentn1b基因表达显著降低(P<0.05);而肾动脉缩窄高血压药物组的Anxa8、Tpm3基因表达显著低于肾动脉缩窄高血压组,而Ren1b基因表达显著高于肾动脉缩窄高血压组(P<0.05);肾性高血压大鼠模型术后六周血管重建后Cygb的表达差异初步研究,发现与正常血压主动脉组比较,高血压大动脉中Cygb的mRNA表达下降(P<0.05);肾动脉缩窄高血压药物组、肾动脉缩窄高血压组的Cygb显著低于正常对照组,颈动脉中膜厚度显著高于正常对照组(P<0.05);肾动脉缩窄高血压药物组的Cygb显著高于肾动脉缩窄高血压组,而颈动脉中膜厚度显著低于肾动脉缩窄高血压组(P<0.05)。结论高血压胞红蛋白表达下降,在高血压血管重建机制中是有益的血管保护因子,可为高血压治疗潜在靶点研究提供生物学根据。

脑红蛋白和细胞红蛋白:携氧蛋白质家族2个新成员

脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)和细胞红蛋白(cytoglobin,Cygb)是新发现的2个携氧蛋白家族的成员.脑红蛋白主要存在于脑中,而细胞红蛋白在全身各个组织都含有,它们和另外2个携氧蛋白———血红蛋白和肌红蛋白的同源性<25%,但它们在种属之间的同源性很高(>95%).脊椎动物脑红蛋白基因定位于14q24,细胞红蛋白基因定位于17q25,都含有4个外显子和3个内含子.2种蛋白在生理条件下含有6个配位键,不同于血红蛋白和肌红蛋白的5个配位键结构.这2种新蛋白和氧都具有很高的亲和力,在缺氧条件下其基因及蛋白表达都有明显的提升,对细胞的存活有一定保护作用.对于脑红蛋白和细胞红蛋白的功能研究,有助于更好地了解机体氧代谢和氧利用过程,并为临床在缺氧损伤时的治疗提供新的观点和途径.