hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用

目的构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体,研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用。方法PCR扩增hTERT核心启动子片段,克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic,检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性。构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERT-CD:UPRT,将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA3.1-CD:UPRT用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞,筛选稳定表达细胞系,用RT-PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5-FC对转染细胞的杀伤作用。结果成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%,而在HLF细胞中仅有背景活性。成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体,转染pcDNA3.1-CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转染hTERT-CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达,且对5-FC敏感;而转染hTERT-CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达,对5-FC不敏感。结论构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5-FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞。

hTERT启动子调控的CD:UPRT/5-FC自杀基因对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶/5-氟胞嘧啶(CD:UPRT/5-FC)融合自杀基因系统在体内对人胃癌SGC7901细胞的杀伤作用。方法:构建胃癌皮下移植瘤模型,随机分成3组处理。观察30天,测量肿瘤体积,计算抑瘤率。肿瘤组织做常规病理检查,免疫组化检测CD蛋白的表达。结果:成功构建胃癌皮下移植瘤模型。治疗30天后,B组(瘤内注射hTERT-CD:UPRT+腹腔注射PBS)和C组(单纯腹腔注射PBS)的肿瘤生长迅速,肿瘤体积分别为(2.72±0.35)cm3、(2.67±0.30)cm3,A组(瘤内注射hTERT-CD:UPRT+腹腔注射5-FC)的肿瘤生长受到明显抑制,第30天体积为(1.10±0.13)cm3,与前两组相比差异有统计学意义(P<0.05),其抑瘤率为59.6%。裸鼠移植瘤病理切片镜检,A组可见大量肿瘤细胞排列稀疏,部分肿瘤细胞核固缩、核碎裂;B组和C组则见大量肿瘤细胞排列紧密,细胞形态和细胞核呈多形性,核大深染,核分裂像多见。免疫组化显示,A组和B组可见CD的表达,C组CD表达呈阴性。结论:hTERT启动子调控的CD:UPRT/5-FC融合自杀基因系统对裸鼠胃癌皮下移植瘤有显著的杀伤作用,为胃癌的基因治疗提供了一种可能的方法。

以超声微泡为载体的胞嘧啶脱氨酶：尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合自杀基因在食管癌细胞株EC9706中的表达

目的 观察超声微泡（UM）介导的胞嘧啶脱氨酶：尿嘧啶磷酸核糖转移酶/5-氟胞嘧啶（CD：UPRT/5-FC）自杀基因系统对人食管癌细胞株EC9706的转染效率和对细胞活力的影响.方法 将EC9706细胞按1×108/L接种于12孔孔板中,随机分为4组：A组：空白对照组;B组：单纯质粒组;C组：单纯超声微泡组;D组：超声微泡＋质粒组.24 h后在荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术（FCM）检测各组的转染效率,Western blot法检测各组细胞CD基因的表达,细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染后细胞的杀伤作用.结果 （1）D组细胞中的绿色荧光强度明显高于其他各组,FCM检测各组转染成功率分别为0％、1.42％、0％、32.60％,超声微泡介导的转染对EC9706细胞活性无明显影响（P＞0.05）;（2）Western blot结果显示D组细胞CD基因蛋白条带灰度值明显高于其他各组（P＜0.05）;（3）5-FC对转染后的肿瘤细胞有明显的杀伤作用,细胞存活率明显下降.结论 采用超声微泡携带CD：UPRT融合自杀基因可显著提高在食管癌细胞中的转染效率,增强5-FC对肿瘤细胞的杀伤作用.