嘧肽霉素对烟草花叶病毒抑制作用研究

嘧肽霉素和烟草花叶病毒(TMV)等体积混合后接种,对心叶烟的枯斑抑制率为96.5%,对系统寄主NC89的防效为84.9%。在接种病毒前24 h喷施药剂,枯斑抑制率和对系统寄主的防效分别为75.4%和69.5%。接种病毒后24 h喷药试验表明,药剂能在一定程度上抑制进入植株体内病毒的增殖。药剂与病毒混合处理后电镜观察,病毒粒子有断裂现象,混合时间越长,破坏作用越强。嘧肽霉素对TMV具有较强的体外钝化作用,且是不可逆的。

嘧肽霉素抗烟草花叶病毒作用机理初步研究

以烟草花叶病毒(TMV)/烟草为测试体系,用3H-尿苷和3H-亮氨酸2种同位素示踪的方法研究了4%嘧肽霉素水剂抗TMV的作用机理。通过3H-尿苷示踪实验发现:无论是叶盘法还是整株法测定,嘧肽霉素均能抑制病毒对3H-尿苷的利用,抑制率分别为72.43%和68.95%;而对寄主植物RNA合成,2种方法的抑制率分别为8.09%和11.02%。通过3H-亮氨酸示踪结果可以看出:嘧肽霉素较强地抑制了病毒对3H-亮氨酸的吸收,但能促进寄主对3H-亮氨酸的吸收。3H-尿苷和3H-亮氨酸分别是RNA和蛋白质合成的前体物,因此,嘧肽霉素通过抑制病毒RNA复制和蛋白质的合成来扰乱病毒的增殖,从而减弱病害的发生。

嘧肽霉素又一抗病毒活性成分的研究

对嘧肽霉素又一抗病毒活性成分进行分离提取及理化性质测定。此活性组分耐高温,100℃处理1h活性不变,在酸性及中性条件下比在碱性条件下稳定;易溶于水,微溶于甲醇,不溶于一般的有机溶剂,吸湿性较强,160℃分解。经紫外吸收光谱、红外吸收光谱及电喷雾电离质谱分析,分子量为1008,不同于已知的核苷类抗生素,为该活性物质的进一步提取精制和结构鉴定提供了理论依据。

嘧肽霉素对烟草花叶病毒在不同寄主上的防效研究

嘧肽霉素是一种新型抗病毒生物农药,针对烟草花叶病毒的不同系统寄主进行了该药剂的防效实验.结果表明:嘧肽霉素对不同系统寄主上的TMV引起的病毒病害都具有很好的防效,对TMV侵染烟草引起的烟草病毒病害的预防较为显著,抑制率达80.4%,在辣椒、番茄上也具有很好的防治效果.

嘧肽霉素在烟叶及土壤中的残留分析及消解动态

研究建立了烟叶及土壤环境中嘧肽霉素残留的高效液相色谱(HPLC)检测方法:鲜烟叶样品采用V(乙腈)∶V(水)=19∶1的混合溶剂提取,干烟叶及土壤样品采用V(乙腈)∶V(水)=17∶3的混合溶剂提取,经PEP-SPE固相萃取柱净化,HPLC检测。结果表明:在0.05～2 mg/kg添加水平下,嘧肽霉素在鲜烟叶、干烟叶和土壤中的平均回收率分别为82.7%～89.6%、78.7%～81.5%和79.6%～97.8%,相对标准偏差(RSD)分别为4.9%～5.7%、2.1%～5.8%和3.2%～6.1%;烟叶和土壤中嘧肽霉素的最小检出量(LOD)均为0.05 mg/kg。采用所建立的方法测定了田间不同施药剂量、施药次数和采收时间下烟叶及土壤样品中嘧肽霉素的消解动态及最终残留。结果表明:嘧肽霉素在鲜烟叶和土壤中的半衰期分别为3.4～5.1 d和1.3～3.1 d;于烟草现蕾-成熟期,以2%嘧肽霉素水剂按有效成分28.2～42.3 g/hm2的剂量施药2～3次,距末次施药后7、14和21 d,烟叶及土壤中嘧肽霉素的残留量均低于LOD值(0.05 mg/kg)。

嘧肽霉素生物合成阻断突变株原生质体制备和再生条件的研究

针对嘧肽霉素的生物合成阻断突变株,研究了其最佳的菌体培养、原生质体制备和再生条件。采用改良的含15%蔗糖、0.5%甘氨酸的YEME液体培养基振荡培养36h,获得细腻丰富的菌丝体;对不同的酶浓度、酶解温度和酶解时间进行3因子4水平的正交试验,筛选最佳酶解条件为:溶菌酶浓度2mg·mL-1,28℃,作用90min,可获得最高的制备率为99%;再生培养基以R2YE为最佳,采取直接涂布方式,25.5℃培养可达48%的再生率。

嘧肽霉素高产菌株的选育

以不吸水链霉菌辽宁变种为出发菌株,经紫外线、亚硝酸诱变和紫外线与嘧肽霉素复合诱变,选育出了嘧肽霉素的高产菌株,抑菌圈直径由原来的20.5mm提高到36.4mm。传代培养5代表明,该高产菌株遗传特性稳定。

嘧肽霉素一种新的生物活性组分分离纯化研究

通过生物活性检测发现Streptomyces tz92菌株嘧肽霉素发酵液中一种新的抗细菌生物活性物质,为了明确其适宜的分离纯化工艺,试验研究了利用大孔吸附树脂,硅胶柱层析和分子筛层析分离纯化该组分的条件和效果。试验结果显示,发酵液经过大孔树脂SP825L吸附50%甲醇洗脱、硅胶柱层析氯仿∶正丁醇∶甲醇∶乙酸=42∶2∶4∶2(体积比)洗脱、Sephadex LH-20 70%甲醇洗脱可以得到该组分纯品。

土壤及番茄中嘧肽霉素残留分析方法研究

通过探索不同提取方法和提取剂对嘧肽霉素在土壤中的提取效果以及不同萃取剂和层析柱对嘧肽霉素在番茄中的净化效果,建立了高效液相色谱法检测嘧肽霉素在土壤及番茄中的残留分析方法。土壤中的嘧肽霉素采用甲醇-水(3/7,V/V)直接振荡-超声提取;番茄中的嘧肽霉素先采用甲醇匀质提取,提取液经二氯甲烷萃取,再经硅胶层析柱净化,高效液相色谱检测分析。试验结果表明:当嘧肽霉素在土壤、番茄中的添加浓度分别为0.05~1.00 mg·kg-1、0.5~5.00 mg·kg-1时,平均添加回收率分别为87.00%~94.31%、89.96%~107.45%,变异系数分别为1.07%~3.98%、4.66%~9.12%,最低检测浓度分别为0.03 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1。对湖南、广州、浙江两年三地的部分样品重复分析可知,该分析方法在土壤中嘧肽霉素的测定变异系数为1.88%~4.56%,在番茄中嘧肽霉素的测定变异系数为3.52%~4.10%。该分析方法均符合农药残留分析方法的检测要求。

Diaion HP20大孔吸附树脂与薄层层析法分离提取嘧肽霉素

通过Diaion HP20大孔吸附树脂及薄层层析法对嘧肽霉素的活性成分进行分离提取。明确了DiaionHP20大孔树脂吸附的最佳pH值、解吸条件、流速以及薄层层析法的最适展开条件。设计的两种方法操作简便,适合嘧肽霉素活性组分的分离,为活性物质的进一步提取精制和结构鉴定提供了依据。

不吸水链霉菌辽宁变种基因转移系统的建立

以嘧肽霉素生物合成阻断突变株UV2136为研究对象,建立了不吸水链霉菌辽宁变种的基因转移系统。UV2136对硫链丝菌素高度敏感,选择含有该抗生素标记的质粒pIJ702和pWHM3,探索其转化UV2136的可能性。结果表明:UV2136含有较强的限制修饰系统,采取热衰减法获得原生质体、原生质体热处理、冷处理、EDTA处理、质粒DNA变性等,均不能实现质粒pIJ702向UV2136的转化。来自非甲基化宿主E.coli ET12567的pWHM3也无法实现转化,而源于E.coli DH5α的甲基化pWHM3,可以低频转化菌株UV2136,转化效率分别为4转化子.μg-1 pWHM3,经自身修饰的pWHM3可实现高效转化,达到104转化子.μg-1pWHM3。

一种快速检测植物病毒RNA蓄积量的竞争PCR方法

用Oligo6.6软件在pUC18上设计1对比目的基因多100-200bp的内参引物，摸索了目的基因和内参共同扩增的竞争PCR反应条件，测定了嘧肽霉素处理对烟草组织中烟草花叶病毒RNA相对含量的影响，同时用间接ELISA方法验证了该方法。试验结果表明：竞争PER的方法能够快速、相对准确的测定植物组织中病毒RNA蓄积量的变化情况。

嘧肽酶素的高效液相色谱分析方法研究

通过对检测波长、流动相配比、流速及柱温4个条件的优化,建立了一种利用高效液相色谱测定嘧肽酶素的定量分析方法。结果表明:在检测波长为250 nm、流动相为甲醇和水的混合液(体积比4∶96)、流速为0.7 mL/min、柱温为30℃的条件下,对嘧肽酶素的分离效果最好,峰形最好,保留时间相对适宜;在0.01～2.0 mg/L范围内呈现良好的线性关系;且该方法操作简便、快速,检测结果稳定性好、准确度高。

嘧肽霉素复配制剂06抗病毒机理初探

针对自主研制的抗病毒农药嘧肽霉素复配制剂06，以普通烟NC89为试材，通过比色法和生物学测定法研究了4种处理（接种TMV，接种TMV前24h喷06，接种TMV后马上喷06，接种TMV后24h喷06）烟株体内病毒浓度的变化。结果表明：嘧肽霉素复配制剂06对病毒的复制和增殖有一定的抑制作用，并且其保护作用好于治疗作用。同时对4种处理（接种TMV，TMV与06混合接种，喷施06不接种，对照）烟株体内防御酶活性的变化进行了研究，结果表明：嘧肽霉素复配制剂06可使烟株CAT、POD、PAL、PPO的活性比对照均有不同程度的提高，酶活高峰集中表现在4—10d。

嘧肽霉素发酵液抗真菌组分的高效液相色谱分析

[目的]采用反相高效液相色谱法分析嘧肽霉素发酵液,外标法测定其中抗真菌组分的含量。[方法]使用DIKMA DiamonsilⅡC18反相柱和紫外可变波长检测器,以甲醇-水(体积比为20∶80)为流动相,流速为1 mL/min,检测波长为278 nm。[结果]嘧肽霉素抗真菌组分保留时间为10.2 min,方法的线性相关系数为0.999 8,样品平均回收率为99.4%,变异系数为0.25%。[结论]该方法是用于发酵控制和用药指导的理想分析方法。

1.8%嘧肽·多抗水剂对水稻纹枯病菌的作用机理

[目的]研究1.8%嘧肽·多抗水剂对水稻纹枯病菌的抑制作用及作用机理。[方法]采用菌丝生长速率测定等方法测定5种不同质量浓度的药剂处理对菌丝生长的抑制效果;测量经药剂处理过的菌丝麦角甾醇含量,丙二醛的含量以及菌悬液的电导率等。[结果]质量浓度22.5~90 mg/L的药剂可完全抑制病菌菌丝生长;经药剂处理过的菌丝,出现畸形、原生质外渗、菌丝分枝不明显乃至断裂的现象;嘧肽·多抗处理过的病菌,丙二醛含量明显增加;随药剂质量浓度和培养时间的增加,培养液的电导率也逐渐增大。[结论]1.8%嘧肽·多抗水剂对水稻纹枯病菌具有较好的抑制作用。该药剂对菌丝形态、菌丝细胞膜透性以及菌丝细胞膜脂质过氧化程度均有一定的影响。

嘧肽霉素诱导烟草BY-2悬浮细胞防卫反应的研究

[目的]利用烟草BY-2悬浮细胞研究抗病毒新农药2%嘧肽霉素水剂诱导植物防卫反应的机制。[方法]用不同质量浓度的嘧肽霉素处理悬浮细胞,分光光度法测定胞外H2O2产生的动态过程及RT-q PCR方法测定防卫反应基因表达。[结果]烟草BY-2悬浮细胞经嘧肽霉素处理,产生活性氧迸发,并在处理1 h后达到高峰;嘧肽霉素能诱导细胞的FLS2、MAPKKK、PR1、NPR1和HSP70的上调表达,其中HSP70的上调效果最为显著。[结论]嘧肽霉素可通过诱导植物防卫反应相关基因的表达,达到诱导植物抗病毒病的作用。