微RNA-30d-5p通过调控ABCB5对胰腺癌进程的影响

目的 探讨微RNA(miR)-30d-5p在胰腺癌(PAAD)中的潜在作用和调控机制。方法 选择2016年12月至2019年1月来新疆维吾尔自治区人民医院接受手术治疗的胰腺癌病人35例,术后即刻获得胰腺肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织,采用实时定量PCR检测miR-30d-5p在胰腺癌组织和细胞中的表达水平。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)、克隆形成、transwell和流式细胞术检测miR-30d-5p对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。通过萤光素酶测定和蛋白质印迹法评估miR-30d-5p对ABCB5表达的调控作用。进一步构建裸鼠成瘤模型通过肿瘤质量和体积验证miR-30d-5p对肿瘤生长的影响。采用苏木精伊红染色验证肿瘤组织增殖情况。结果 与癌旁组织(1.03±0.17)及正常细胞(0.98±0.18)相比,胰腺癌组织(0.35±0.08)和细胞(0.63±0.08,0.23±0.07,0.48±0.07及0.31±0.05)中miR-30d-5p的表达显著降低(P<0.05);miR-30d-5p的过表达抑制了肿瘤细胞的活力、迁移和侵袭并促进了细胞凋亡且差异有统计学意义(P<0.05);抑制ABCB5的表达能抑制细胞活力、迁移和侵袭性并促进了胰腺癌的细胞凋亡且差异有统计学意义(P<0.05);体内实验证明miR-30d-5p组能够抑制肿瘤生长且差异有统计学意义(P<0.05)。结论MiR-30d-5p通过靶向ABCB5影响胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡,可能是PC病人潜在的预后生物标志物及靶向治疗的靶点依据。

TGF-β_(1)通过miR-21d-5p调控BMP7表达诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移

目的:探讨转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))可能通过微小RNA-21d-5p(miR-21d-5p)对骨形态发生蛋白7(BMP7)的调控,从而对肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的影响及可能机制。方法:观察TGF-β_(1)处理的肾小管上皮细胞HK-2并检测miR-21d-5p的表达,在HK-2细胞中分组转染miR-21d-5p或anti-miR-21d-5p,再使用TGF-β_(1)处理,观察过度表达或抑制表达miR-21d-5p对TGF-β_(1)诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响。分析TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的靶向关系。共转染miR-21d-5p和pcDNA3.1-BMP7,或anti-miR-21d-5p和si-BMP7,使用TGF-β_(1)处理,评估TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的在肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的相互关系。结果:TGF-β_(1)处理HK-2细胞后,miR-21d-5p表达和迁移细胞数量升高(P<0.05),P21和E-钙黏蛋白(E-cadherin)水平降低(P<0.05)。过度表达miR-21d-5p增加TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移上调(P<0.05),降低P21和E-cadherin蛋白表达(P<0.05),过度表达BMP7可以逆转此过程。抑制miR-21d-5p降低TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移细胞水平(P<0.05),显著升高P21和E-cadherin蛋白水平(P<0.05),被抑制表达的BMP7可以逆转此过程。结论:TGF-β_(1)可能通过miR-21d-5p靶向调控BMP7表达,从而诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移,进一步影响肾脏纤维化进展。

化瘀杀胚汤联合甲氨蝶呤治疗异位妊娠的疗效及对TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p表达量的影响

【目的】探讨化瘀杀胚汤(由丹参、赤芍、桃仁、蜈蚣、紫草、天花粉、三七等中药组成)联合甲氨蝶呤治疗异位妊娠疗效及对患者TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p表达量的影响。【方法】将104例异位妊娠患者随机分为观察组和对照组,每组各52例。对照组给予甲氨蝶呤联合米非司酮治疗,观察组在对照组的基础上加用化瘀杀胚汤治疗,连续用药3 d并随访观察1个月。比较2组患者保守治疗成功率、血β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)水平恢复正常时间以及异位妊娠包块吸收时间、治疗后输卵管完全通畅率与不通畅率,观察2组保守治疗成功患者治疗前后血清TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p相对表达量的变化情况。【结果】(1)观察组的保守治疗成功率为94.23%(49/52),明显高于对照组的71.15%(37/52),差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组比较,观察组的血β-HCG恢复正常时间及包块吸收时间均明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.01)。(3)观察组治疗后的输卵管完全通畅率为55.77%(29/52),明显高于对照组的21.15%(11/52);不通畅率为19.23%(10/52),明显低于对照组的59.62%(31/52),差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(4)与治疗前比较,2组保守治疗成功患者治疗结束1个月后的TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p相对表达量均明显降低(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,观察组治疗结束1个月后的TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。(5)2组患者的不良反应均以胃肠道不适为主,观察组的不良反应发生率为25.00%(13/52),明显低于对照组的46.15%(24/52),组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】化瘀杀胚汤联合甲氨蝶呤治疗异位妊娠,可有效提高药物保守治疗的成功率,有助于包块的吸收以及输卵管通畅,能有效降低患者的TGF-β/Smad2/3蛋白水平及microRNA-30d-5p的相对表达量,且药物安全性较高。

胃癌组织微小RNA-181d-5p和三基序蛋白22表达与患者术后5年内生存相关性研究

目的:探讨胃癌组织微小RNA-181d-5p(miR-181d-5p)和三基序蛋白22(TRIM22)表达与患者术后5年内生存的关系。方法:收集110例胃癌患者(均是胃腺癌)术中切除的胃癌组织标本及癌旁组织标本。荧光定量PCR和免疫组织化学法分别检测miR-181d-5p和TRIM22蛋白表达。患者术后随访5年,记录生存情况。Starbase数据库预测miR-181d-5p与TRIM22结合位点,并验证miR-181d-5p与TRIM22的靶向关系。比较癌旁和胃癌组织miR-181d-5p、TRIM22表达,不同临床病理特征患者胃癌组织miR-181d-5p、TRIM22表达差异。分析胃癌组织miR-181d-5p、TRIM22表达与患者预后的关系,胃癌患者预后的影响因素,以及胃癌组织miR-181d-5p与TRIM22及它们与不同临床病理特征的相关性。结果:与癌旁组织比较,胃癌组织miR-181d-5p表达升高,TRIM22阳性率降低(均P<0.05)。肿瘤低分化、肌层或外膜浸润、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ期在miR-181d-5p高表达和TRIM22阴性表达患者中的比例分别高于肿瘤高分化、黏膜或膜下层浸润、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期(均P<0.05)。miR-181d-5p与TRIM22具有靶向结合位点,miR-181d-5p可负向调控TRIM22表达。miR-181d-5p高表达和TRIM22阴性表达患者5年总生存率分别低于miR-181d-5p低表达和TRIM22阳性表达患者(均P<0.05)。影响胃癌患者术后5年内生存的独立危险因素有miR-181d-5p高表达、TRIM22阴性表达、肿瘤低分化、肌层或外膜浸润、有淋巴结转移和TNM分期Ⅲ期(均P<0.05)。胃癌组织miR-181d-5p与TRIM22、肿瘤分化程度呈负相关,与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期呈正相关(均P<0.05);TRIM22与肿瘤分化程度呈正相关,与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期呈负相关(均P<0.05)。结论:胃癌组织miR-181d-5p表达升高,TRIM22阳性率降低,两者与患者临床病理特征和术后5年内生存有密切关系。

miR-30d-5p对宫颈癌细胞生长和转移的影响

目的探究miR-30d-5p在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌细胞的恶性生物学行为的影响。方法qRT-PCR检测宫颈癌组织、癌旁组织和正常宫颈细胞、宫颈癌细胞中miR-30d-5p的表达。将模拟物阴性对照(mimic NC)和miR-30d-5p模拟物(miR-30d-5p mimic)转染至SiHa细胞,采用qRT-PCR检测miR-30d-5p的转染效率;CCK-8和细胞克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕闭合实验和Transwell法分别检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测细胞凋亡和侵袭相关蛋白的表达。结果与癌旁组织相比,宫颈癌组织中miR-30d-5p的表达显著下调(P<0.01)。与Ect1/E6E7细胞相比,宫颈癌细胞系中miR-30d-5p的表达水平均显著降低(P<0.01)。miR-30d-5p的过表达抑制了SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡(P<0.01)。此外,miR-30d-5p的过表达显著下调了Bcl-2、N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平(P<0.01),显著上调了Bax、cleaved caspase-3和E-钙黏蛋白的表达水平(P<0.01)。结论miR-30d-5p在人宫颈癌组织及相关宫颈癌细胞系中显著下调,miR-30d-5p通过抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,在体外对宫颈癌细胞起抑癌作用,提示miR-30d-5p可能是宫颈癌患者诊断和治疗的潜在新靶点。

miR-495-3p、miR-181d-5p在宫颈癌患者中的表达及临床意义

目的探讨miR-495-3p、miR-181d-5p在宫颈癌及宫颈癌前病变组织中的表达差异及对宫颈癌诊断的价值。方法收集2020年6月—2022年12月河北中石油中心医院收治的30例宫颈低级别鳞状上皮内病变(CINⅠ级组)、30例宫颈高级别鳞状上皮内瘤变(CINⅡ~Ⅲ级组)、50例宫颈癌(宫颈癌组)患者的临床资料及宫颈组织标本。采用免疫组化法检测各组宫颈组织中miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达情况,比较各组miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达率;采用RT-qPCR法检测宫颈癌组患者癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达量,分析miR-495-3p和miR-181d-5p表达量与宫颈癌患者临床病理特征的关系、miR-495-3p和miR-181d-5p对宫颈癌的诊断价值及二者在宫颈癌组织中表达的相关性。结果宫颈癌组miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达率均明显低于CINⅠ级组及CINⅡ~Ⅲ级组(P均<0.05)。宫颈癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达量与FIGO分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关(P均<0.05),FIGO分期越高、浸润越深二者表达量越低;miR-181d-5p表达量与分化程度有关(P<0.05),分化程度越高miR-181d-5p表达量越低。miR-495-3p、miR-181d-5p联合检测对宫颈癌的诊断价值高于miR-495-3p、miR-181d-5p单一检测(P=0.001)。宫颈癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达呈正相关。结论miR-495-3p、miR-181d-5p表达量与宫颈癌患者的FIGO分期、浸润深度、淋巴结转移情况相关,两者表达之间具有一定相关性,二者联合检测有助于宫颈癌的诊断。

微小RNA-30d-5p通过葡萄糖调节蛋白78调控骨髓基质细胞成骨分化的机制

目的探讨微小RNA(miR)-30d-5p对骨髓基质细胞成骨分化和凋亡的影响及其作用机制。方法将骨髓基质细胞分为miR-30d-5p过表达阴性对照组、miR-30d-5p过表达组、miR-30d-5p抑制阴性对照组和miR-30d-5p抑制组。碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨效果,茜素红染色检测钙结节沉淀情况,TUNEL检测凋亡水平。Real-time PCR、Western blotting检测mRNA和蛋白表达水平,生物信息学分析网站Targetscan 7.1预测miR-30d-5p的潜在结合位点。结果MiR-30d-5p过表达后,细胞成骨分化能力和矿化能力均降低(P<0.05),而细胞凋亡水平升高(P<0.05)。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和成骨特异性Runt相关转录因子2(RUNX2)蛋白表达均显著降低(P<0.05)。但是,miR-30d-5p抑制剂处理细胞后,细胞成骨分化能力和矿化能力均有提升(P<0.05),细胞凋亡水平降低(P<0.05)。GRP78和RUNX2蛋白水平均升高(P<0.05)。MiR-30d-5p结合位点位于GRP78基因3’UTR的142~148 bp处。结论MiR-30d-5p通过下调GRP78蛋白的表达抑制骨髓基质细胞成骨分化,并且促进细胞凋亡。

gga-miR-30d-5p表达分析及其对鸡脂肪沉积的调控作用

【目的】分析gga-miR-30d-5p在鸡腹脂和肌内脂肪沉积中的作用,为进一步阐明鸡腹脂和肌内脂肪沉积的分子机制提供理论依据。【方法】实时荧光定量PCR检测gga-miR-30d-5p在S3系鸡和隐性白羽鸡不同发育时期不同组织中的表达,转染gga-miR-30d-5p mimics和inhibitor,观察脂肪细胞脂肪沉积的变化。【结果】gga-miR-30d-5p在心脏、肝脏、脾脏、皮脂、腹脂、胸肌、肾脏、卵巢和腿肌组织中均有表达。在腹脂组织中,gga-miR-30d-5p在0周龄时的表达存在显著的品种差异(P<0.05,下同),且在0周龄时的表达均显著高于其他周龄;肝脏组织中,gga-miR-30d-5p在0、14和16周龄的表达存在显著的品种差异,gga-miR-30d-5p在S3系鸡中的表达随着发育时期的增长逐渐升高,16周龄的表达显著高于其他周龄;在隐性白羽鸡,16周龄的表达最高且显著高于8周龄;腿肌组织中,gga-miR-30d-5p在2周龄时的表达存在显著的品种差异性。在脂肪细胞中,gga-miR-30d-5p在诱导分化4 d后的表达均显著高于增殖期;转染gga-miR-30d-5pmimics,脂肪细胞脂滴沉积极显著升高(P<0.01,下同);转染gga-miR-30d-5pinhibitor脂肪细胞脂滴沉积能力极显著下降。靶基因GO功能注释和KEGG信号通路富集分析结果显示,SOCS3和PGP可能是gga-miR-30d-5p调控脂肪沉积的预测靶基因。【结论】gga-miR-30d-5p在鸡的肝脏、腹脂和腿肌组织中表达存在显著的品种差异,转染gga-miR-30d-5p mimics/inhibitor脂肪细胞脂滴沉积极显著升高或降低。gga-miR-30d-5p具有促进鸡腹脂和肌内脂肪沉积的作用。

牵张刺激下牙周膜细胞外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用

目的探索牵张加载下牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)外泌体对成骨细胞分化的影响,以及牵张加载下PDLCs外泌体在力相关牙周组织改建中的调控作用。方法对体外培养人PDLCs施加20%牵张应变后,提取上清中的外泌体与成骨细胞共培养,检测成骨细胞分化情况,并探索外泌体中发挥调控作用的miRNA。结果牵张加载下PDLCs分泌的外泌体可上调成骨细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、转录因子Osterix(Osx)、I型胶原蛋白(type I collagen,COL-1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP 2)等成骨相关因子表达,促进细胞成骨向分化。牵张加载下PDLCs外泌体差异表达miRNA中,miRNA-181d-5p表达量上调达107倍,将其转染成骨细胞后,成骨细胞中ALP、Osx、Col-1、Runx2、Ocn和BMP2等成骨相关因子表达亦增加。结论本研究初步揭示了牵张加载下PDLCs外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用,对于明确力相关牙周组织改建中的信号通路具有重要科学意义。

乌头碱调控miR-181d-5p/DDX3轴对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨乌头碱通过调控微小RNA-181d-5p(miR-181d-5p)/DEAD-box RNA解旋酶3(DDX3)轴对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响。方法使用不同剂量乌头碱处理宫颈癌HeLa细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖确定给药剂量。将HeLa细胞分为对照组(正常培养,不进行处理),乌头碱低剂量组(4 mg/L)、中剂量组(8 mg/L)、高剂量组(16 mg/L),顺铂组(5 mg/L),乌头碱高剂量+miR-NC组[16 mg/L乌头碱+转染miR-181d-5p siRNA阴性对照(miR-NC)质粒]及乌头碱高剂量+miR-181d-5p低表达组[16 mg/L乌头碱+转染miR-181d-5p小干扰RNA(siRNA)质粒]。平板克隆形成实验及流式细胞仪分别检测各组HeLa细胞克隆形成数与凋亡情况;实时荧光定量PCR检测HeLa细胞中miR-181d-5p和DDX3 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法检测HeLa细胞中DDX3、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平;双萤光素酶报告基因实验验证miR-181d-5p与DDX3的靶向关系。结果以0.5~64 mg/L的乌头碱分别处理HeLa细胞24 h、48 h、72 h后,对HeLa细胞均有不同程度的抑制作用,选择剂量为4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L的乌头碱用于后续实验。与对照组比较,乌头碱低、中、高剂量组及顺铂组HeLa细胞克隆形成数、DDX3 mRNA和蛋白、Cyclin D1、PCNA、Bcl-2蛋白表达水平依次降低(P<0.05),凋亡率、miR-181d-5p、Bax、Caspase-3蛋白表达水平依次升高(P<0.05);与乌头碱高剂量组和乌头碱高剂量+miR-NC组比较,乌头碱高剂量+miR-181d-5p低表达组HeLa细胞克隆形成数、DDX3 mRNA和蛋白、Cyclin D1、PCNA、Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05),凋亡率、miR-181d-5p、Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05);双萤光素酶报告基因检测证实miR-181d-5p与DDX3存在靶向关系。结论乌头碱可调控miR-181d-5p/DDX3轴,促进miR-181d-5p表达,抑制DDX3表达,进而抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,促进细胞凋亡。

血清外泌体miR-30d-5p靶向RHOB在三氯乙烯药疹样皮炎中的作用

目的检测三氯乙烯药疹样皮炎(OMDT)患者血清外泌体中miR-30d-5p的表达水平及其与肝功能的相关性,再对miR-30d-5p进行生信分析并验证下游靶基因RHOB。方法收集6例OMDT患者和6例健康对照者血清样本提取血清外泌体。透射电镜、纳米粒子跟踪分析以及Western blot法对外泌体进行鉴定后提取miRNA,检测其中miR-30d-5p表达水平并与肝功能作相关性分析,用miRWalk及miRBD数据库预测miR-30d-5p的靶基因,进行功能聚类和途径富集分析,最后通过双荧光素酶报告基因实验验证靶基因RHOB。结果6例OMDT患者在发病高峰期时血清外泌体中miR-30d-5p表达水平明显降低(P<0.05),并且与肝功能指标丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰胺基转移酶水平均呈负相关(相关系数分别为:r_(s)=-0.943,P=0.005;r_(s)=-0.886,P=0.019;r_(s)=-0.886,P=0.019)。生信分析及双荧光素酶报告基因实验显示RHOB是miR-30d-5p的直接靶基因。结论OMDT患者血清外泌体miR-30d-5p表达降低,与肝功能指标呈负相关,并且可能通过靶向RHOB参与三氯乙烯所致肝损伤过程。

LncRNA MALAT1通过调控miR-181d-5p对脂多糖诱导的库普弗细胞增殖活性和炎性因子表达的影响

目的探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1(LncRNA MALAT1)对脂多糖(LPS)诱导的库普弗细胞(kupffer cells,KCs)存活和炎性因子表达的影响及其可能作用机制。方法采用LPS诱导KCs建立细胞损伤模型,随机分组为对照(Con)组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-MALAT1组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-181d-5p组、LPS+si-MALAT1+anti-miR-NC组、LPS+si-MALAT1+anti-miR-181d-5p组;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测LncRNA MALAT1、miR-181d-5p的表达量;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖活性;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-6、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平;双荧光素酶报告实验检测LncRNA MALAT1与miR-181d-5p的靶向关系。结果与Con组比较,LPS组LncRNA MALAT1的表达量升高(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平升高(P<0.05),miR-181d-5p的表达量降低(P<0.05),细胞增殖活性降低(P<0.05)。与LPS+si-NC组比较,LPS+si-MALAT1组细胞增殖活性升高(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平降低(P<0.05)。LncRNA MALAT1可负向调控miR-181d-5p的表达;与LPS+miR-NC组比较,LPS+miR-181d-5p组细胞增殖活性升高(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平降低(P<0.05)。与LPS+si-MALAT1+antimiR-NC组比较,LPS+si-MALAT1+anti-miR-181d-5p组细胞增殖活性降低(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平升高(P<0.05)。结论干扰LncRNA MALAT1表达可通过促进miR-181d-5p表达而促进LPS诱导的KCs存活及抑制细胞炎性因子表达。

环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)通过调控miR-181d-5p/miR-199a-5p促进口腔鳞状细胞癌进展

目的:探讨环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞生物学功能中的作用及机制。方法:收集30例OSCC患者的临床组织,采用实时定量PCR检测circFAT1、miR-181d-5p及miR-199a-5p在OSCC组织和细胞中的表达。通过StarBase和双荧光素酶报告基因实验验证miR-181d-5p/miR-199a-5p与circFAT1的靶向关系。利用CCK-8、Transwell、流式细胞术检测circFAT1-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴对于OSCC细胞活力、迁移、侵袭、凋亡和周期的影响。采用免疫印迹法结合LY294002处理检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果:在OSCC中circFAT1表达升高,miR-181d-5p、miR-199a-5p表达下降(P<0.001)。circFAT1可以同时靶向miR-181d-5p和miR-199a-5p(P<0.01)。沉默circFAT1、过表达miR-181d及miR-199a-5p抑制了OSCC细胞活力、迁移、侵袭和周期进展、诱导凋亡,同时抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活;过表达circFAT1、抑制miR-181d-5p及miR-199a-5p则发挥相反作用(P<0.05)。miR-181d-5p、miR-199a-5p可部分逆转circFAT1对OSCC细胞生物学功能的影响(P<0.05)。LY294002预处理逆转了过表达circFAT1对PI3K/Akt/mTOR通路和细胞活力的影响(P<0.05)。结论:circFAT1通过调控miR-181d-5p和miR-199a-5p促进OSCC细胞恶性进展。

miR-143和miR-520d-5p在胃癌组织中的异常表达

目的应用MicroRNAs(miRNAs)芯片技术筛选胃癌组织中差异表达的miRNAs,研究与胃癌相关的miRNAs。方法从3对手术切除的胃和相配对的正常胃组织中提取总RNA,miRNA芯片检测miRNA表达情况,然后在47例配对的胃癌和正常胃组织中,用Real-time RT-PCR(Taqman)对部分差异表达miRNA进行验证。结果芯片结果显示:与配对的正常胃组织相比,有62个miRNAs在胃癌中异常表达,其中42个miRNA高表达,20个miRNA低表达。用Real-time RT-PCR(Taqman)验证显示:miR-143在胃癌组织中表达显著降低(P=0.002 9);miR-520d-5p在胃癌组织中表达显著提高(P=0.032)。结论miR-143和miR-520d-5p可能参与了胃癌的发生过程。

miR-30d-5p对转化生长因子-β1诱导肾小管上皮细胞生长及迁移的影响

目的 miR-30d-5p是否影响转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞生长及迁移尚不清楚。文中旨在研究miR-30d-5p对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞生长和迁移的影响及机制。方法 TGF-β1处理肾小管上皮细胞HK-2,分为:空白组(未经任何处理)、TGF-β1组、miR-NC组(转染miR-30d-5p阴性对照miR-NC)、miR-30d-5p组(转染miR-30d-5p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-30d-5p阴性对照anti-miR-NC)、anti-miR-30d-5p组(转染anti-miR-30d-5p)、miR-30d-5p+pcDNA3.1组(转染miR-30d-5p与pcDNA3.1-BMP7阴性对照pcDNA3.1)、miR-30d-5p+pcDNA3.1-BMP7组(转染miR-30d-5p与pcDNA3.1-BMP7)、anti-miR-30d-5p+si-NC组(转染anti-miR-30d-5p与si-BMP7阴性对照si-NC)、anti-miR-30d-5p+si-BMP7组(转染anti-miR-30d-5p与si-BMP7)。除空白组外,其他各组经TGF-β1处理。qPCR检测miR-30d-5p的表达,Western blot检测P21和E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达, MTT检测细胞活性,Transwell检测细胞迁移,观察过表达miR-30d-5p或抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响。生物信息学预测和双荧光素酶报告实验分析miR-30d-5p与骨形态发生蛋白7(BMP7)的靶向关系。评估其在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞细胞活性及迁移中的作用。结果 TGF-β1组肾小管上皮细胞的miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数较空白组明显升高(P<0.05),P21和E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。miR-30d-5p组肾小管上皮细胞miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数较miR-NC组明显增加(P<0.05),P21和E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较, anti-miR-30d-5p组肾小管上皮细胞的miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数明显降低(P<0.05),P21和E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-30d-5p组WT-BMP7荧光素酶的活性、BMP7 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较,anti-miR-30d-5p组的BMP7 mRNA表达显著升高(P<0.05)。anti-miR-30d-5p+si-BMP7组肾小管上皮细胞的BMP7、P21和E-cadherin蛋白水平[(0.21±0.03)、(0.29±0.03)、(0.37±0.04)]较anti-miR-30d-5p+si-NC组[(0.71±0.05)、(0.53±0.04)、(0.63±0.05)]明显降低(P<0.05),生长率和迁移细胞数显著升高(P<0.05)。结论 miR-30d-5p通过靶向调控BMP7的表达促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞生长及迁移,为肾间质纤维化的机制研究提供了指导意义。

MicroRNA-181d-5p通过PTEN参与睾丸支持细胞间紧密连接损伤

目的:探讨miR-181d-5p通过与人第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源的基因(PTEN)mRNA 3'UTR区相互作用,参与小鼠睾丸支持细胞TM4细胞间紧密连接损伤及其可能机制。方法:通过网站预测miR-181d-5p的靶基因为PTEN mRNA,采用双荧光素酶报告基因分析实验在293T细胞上验证其与靶基因3'UTR区的结合;在TM4细胞上采用mimic过表达miR-181d-5p,引起PTEN蛋白表达降低,再进行p-FAK-Tyr397、p-Akt-Thr308等相关信号分子检测以及细胞间跨膜电阻(TER)值的测定。结果:MiR-181d-5p能与PTEN mRNA的3'UTR区结合,并降低其表达;在TM4细胞上过表达miR-181d-5p后,致使p-FAK-Tyr397和p-Akt-Thr308水平升高,以及TER值降低。结论:MiR-181d-5p通过与PTEN mRNA 3'UTR区结合降低其表达,引起p-FAK-Tyr397水平升高,以及PI3K/Akt信号通路激活,导致睾丸支持细胞间紧密连接损伤。

红景天苷通过调节miR-30d-5p表达减弱大鼠心肌细胞肥大的机制研究

[目的]研究红景天苷(salidroside,SAL)调控微小RNA(microRNA,miR)改善大鼠心肌肥大的机制。[方法]采用苯肾上腺素(phenylephrine,PE)刺激新生大鼠心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,以miR基因芯片筛选出3组细胞(正常对照组、模型组和SAL组)中有显著差异的miR,利用生物信息学方法和双荧光素酶报告基因确定靶基因。以Real-time PCR与Western blot分别检测靶基因mRNA及蛋白表达。在分别以SAL、候选miR模拟物和抑制物干预后,检测心肌细胞的表面积,分析靶基因和靶蛋白的表达。[结果]基因芯片结果表明,模型组与正常对照组有14种miR存在显著差异,SAL组与模型组有10种miR存在显著差异。模型组miR-30d-5p表达水平显著低于正常对照组和SAL组(P<0.05),而SAL组miR-30d-5p表达量与正常对照组无统计学差异(P>0.05)。生物信息学方法和双荧光素酶报告基因测定确定葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein78,GRP78)是miR-30d-5p的靶基因。SAL能够上调PE刺激诱导的肥大心肌细胞的miR-30d-5p水平,抑制心肌细胞表面积增大;miR-30d-5p模拟物能抑制心肌细胞GRP78蛋白表达,而miR-30d-5p抑制物的作用结果相反。[结论]miR-30d-5p具有抑制心肌肥大的作用,SAL可能通过增加心肌细胞中miR-30d-5p的表达,抑制GRP78 mRNA及蛋白表达,从而改善心肌肥大。

长链非编码RNA LINC00641通过微小RNA-181d-5p靶向真核细胞翻译起始因子4A2抑制宫颈癌细胞增殖的研究

目的观察长链非编码RNA(LncRNA)LINC00641(LINC00641)在宫颈癌细胞中的表达特征,探讨LINC00641通过微小RNA-181 d-5p(miR-181 d-5p)/真核细胞翻译起始因子4A2(EIF4A2)对宫颈癌细胞增殖的调节作用。方法选择宫颈癌Hela细胞株,建立空白对照组,构建转染pc-DNA3.1的无关序列组､转染pc-DNA3.1-LINC00641的pc-DNA-LINC00641组､转染pc-DNA3.1-LINC00641-siRNA的si-LINC00641组,转染miR-181 d-5p inhibitor的miR-181 d-5p inhibitor组､转染miR-181 d-5p mimic的miR-181 d-5p mimic组､转染siRNA-EIF4A2的si-EIF4A2组。采用CCK-8实验检测细胞增殖活性,采用双荧光素酶报告基因实验观察LINC00641和miR-181 d-5p､miR-181 d-5p､EIF4A2的靶向关系。选取2019年12月至2021年1月陕西中医药大学第二附属医院诊治的45例宫颈鳞癌且未行术前新辅助放､化疗的女性患者作为研究对象,留取其术后肿瘤组织(宫颈鳞癌组织)。另选取45例因子宫肌瘤行子宫全切术,且经病理确诊为慢性宫颈炎的患者,留取其宫颈组织(慢性宫颈炎组织)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测LINC00641和miR-181 d-5p的表达,采用免疫组化SP法检测EIF4A2和Ki67的表达,采用Pearson检验分析其相关性。结果生物信息分析显示,LINC00641与miR-181 d-5p､miR-181 d-5p､EIF4A2具有可能的结合位点。与空白对照组和无关序列组比较,pc-DNA-LINC00641组､miR-181 d-5p mimic组､si-EIF4A2组细胞增殖活性下降,si-LINC00641组､miR-181 d-5p inhibitor组细胞增殖活性升高。双荧光素酶报告基因实验显示,LINC00641与miR-181 d-5p､miR-181 d-5p､EIF4A2具有靶向关系。挽救实验显示,沉默EIF4A2可部分逆转沉默LINC00641和沉默miR-181 d-5p对细胞增殖的促进作用。与慢性宫颈炎组织比较,宫颈鳞癌组织中LINC00641､miR-181 d-5p低表达,EIF4A2高表达(P<0.05)。Pearson相关分析显示,LINC00641与miR-181 d-5p､EIF4A2､Ki67呈正相关性,miR-181 d-5p与EIF4A2呈负相关性。结论LINC00641通过miR-181 d-5p/EIF4A2抑制宫颈癌细胞的增殖,调控肿瘤的形成和进展。

DLEU2靶向miR-30d-5p影响舌鳞癌细胞增殖和凋亡的分子机制

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)DLEU2对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞增殖及凋亡的影响及其可能的作用机制。方法利用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测TSCC组织及癌旁组织中DLEU2的表达水平。将pcDNA3.1-DLEU2、pcDNA3.1、si-DLEU2、si-NC分别转染入TSCC Tca8113细胞,pcDNA3.1-DLEU2与miR-30d-5p、miR-NC分别共转染入TSCC Tca8113细胞,采用qRT-PCR法验证转染效率。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及流式细胞仪分别检测转染后各组细胞增殖及凋亡能力的改变。双荧光素酶报告检测DLEU2与miR-30d-5p的靶向调控作用。Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关x蛋白(Bax)蛋白表达。结果相对于癌旁组织,TSCC组织中DLEU2的表达水平显著下调(P<0.05)。Tca8113细胞中转染pcDNA3.1-DLEU2能显著上调DLEU2表达水平,降低细胞增殖能力,增强细胞凋亡能力,上调p21、Bax表达,下调CyclinD1、Bcl-2表达(均P<0.05);双荧光素酶报告基因检测显示miR-30d-5p是DLEU2的直接靶点;与pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组比较,Tca8113细胞中共转染pcDNA3.1-DLEU2与miR-30d-5p后,增强细胞增殖能力,降低细胞凋亡能力,抑制p21、Bax表达,而促进CyclinD1、Bcl-2表达(均P<0.05)。结论LncRNA DLEU2可通过抑制miR-30d-5p表达进而抑制TSCC细胞增殖及诱导细胞凋亡。

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性;实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达;利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因,并进行GO和KEGG富集分析;使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体,并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞,进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系,测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物(miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics)、抑制物(miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor)、阴性对照(NC)及其靶基因的干扰siRNA(Gene-siRNA),转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后,分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况,油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】保守性分析结果表明,miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性;miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示,miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达;靶基因预测结果表明,miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶(GPD2)和环腺苷酸反应元件(CREB1);GO和KEGG功能富集分析发现,miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成,调节脂肪细胞分化,且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<-87.8 kJ/mol;双荧光素酶报告基因试验结果表明,转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性(P<0.01),但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明,与未分化脂肪细胞(0 d)相比,miR-181a表达量在分化的第4天显著升高(P<0.05),到第6天达到极显著差异(P<0.01);miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高(P<0.01)。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果,与NC组相比,mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升(P<0.01),inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降(P<0.01);mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降(P<0.01),inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升(P<0.01);mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升(P<0.05;P<0.01),inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降(P<0.05);油红O染色结果表明,与NC组相比,mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加,inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3′-UTR区域序列,降低GPD2和CREB1基因的表达,促进猪前体脂肪细胞成脂分化。