dCas9基因激活系统在HIV体外扩增检测中的应用

目的改进和提高HIV体外扩增检测的灵敏度,缩短检测时间。方法 1)用Broad Institute gRNA设计工具选取HIV的长末端重复序列(LTR)段设计20条gRNA(引导RNA)。2)用含荧光素酶报告的基因HIV(HIV-Luc)感染具有dCas9基因激活系统的Jurkat6465细胞系构建Jurkat6465-Luc细胞系,并将20条gRNA置于Jurkat6465-Luc细胞系中筛选出激活能力筛选,选取效率最高的gRNA-L,gRNA-L与dCas9基因激活系统包装成慢病毒感染Jurkat细胞系,建立可对HIV序列高效扩增的工作细胞系Jurkat6465-L。3)用HIV-Luc感染Jurkat细胞系构建HIV潜伏测试细胞系,设定其潜伏频率为1∶500,并与工作细胞Jurkat6465-L置于细胞培养箱中共同培养7和14 d观察工作细胞对HIV潜伏细胞系的激活能力。4)使用HIV激活剂SAHA和dCas9基因激活系统分别作用于设定潜伏频率为1∶500的潜伏细胞,分别比较对潜伏HIV的激活能力。结果首先,测定荧光素酶活性筛选出的2条具有高效HIV扩增能力的gRNA-L和gRNA-O,二者及对照组促进Jurkat6465-Luc的扩增效力(荧光素酶活性强度)(n=3,pg/mL),6 d分别为:85 530±979.2 vs 96 925±2 759 vs 9 876±437(P<0.01);选取gRNA-L与dCas9基因激活系统构建的Jurkat6465L细胞系作为工作细胞,测试设定潜伏频率为1/500的HIV潜伏测试细胞,在培养7、14 d激活HIV潜伏测试细胞的频率测定分别1/864和1/755,比培养14 d用SAHA激活HIV潜伏模型细胞频率1/1 180更接近设定潜伏频率值1/500;用HIV潜伏细胞测试dCas9基因激活系统激活HIV潜伏细胞频率1/615与对照SAHA激活剂激活HIV潜伏细胞频率1/749相比,更接近于设定频数1/500。结论 dCas9基因激活系统改进HIV体外扩增,可以提高HIV体外扩增检测的效率和灵敏度。

比较两种转录激活系统对生殖相关基因的表达调控

运用由CRISPR/Cas9技术延伸的两种转录激活系统Cas9-p300和dCas9-VPR分别激活生殖特化相关基因,比较它们针对生殖细胞特化基因的激活效率。实时荧光定量PCR结果表明,这两种激活系统均可激活大部分目的基因的表达。其中, Cas9-p300系统激活BLIMP1基因的效率更高, dCas9-VPR系统激活NANOS2、DAZL、SOX17基因的效率更高,两种系统在激活DDX4、TFAP2C基因时效率无显著性差异。由此,本研究通过比较Cas9-p300和dCas9-VPR转录激活系统调控生殖特化相关基因的表达,揭示了不同的转录激活系统在激活生殖特化相关基因时的不同效率,这将为利用转录激活系统研究生殖细胞分化提供理论基础,也将为研究其他发育系统中细胞命运的转变提供借鉴。

基因编辑技术的研究进展

功能缺失(loss of function)是研究基因功能及其相关表型最重要、最直接的方法和策略。基因编辑技术从开始的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术到近年发展起来的高效酶技术都得到了广泛的应用。这些高效酶技术包括锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术、转录激活样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9 system,CRISPR/Cas9)。除此之外,还有2016年发表的Ng Ago(Natronobacterium gregoryi Argonaute)编辑技术。近十年来,以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术已经广泛应用于细胞水平和个体水平的基因功能敲除的研究。现就以上基因编辑技术的原理及最新进展进行综述,并重点介绍CRISPR/Cas9的技术原理以及该技术在建立基因敲除动物模型中的最新进展。

CRISPR系统转化医学研究进展

CRISPR系统作为在现今科学研究中对基因编辑运用广泛的一项技术,在后基因组学时代对于基因功能研究、疾病发生发展机制以及基因靶向药物等研究具有重要意义。目前人们运用CRISPR/Cas9编辑技术成功构建细胞和模式生物模型用于临床医学研究。CRISPR/Cas9作为一类强大的基因编辑技术不单只运用于基因功能缺失或外源基因敲入等研究中,CRISPR基因敲除文库筛选系统、CRISPR/dCas9基因激活系统、CRISPR干扰技术和CRISPR分子诊断技术等CRISPR转化医学研究将CRISPR应用于基因高通量筛选、基因沉默导致疾病发生、跨表观遗传修饰激活基因表达、可逆性干扰靶标基因表达以及运用CRISPR分子诊断检测病原微生物感染性疾病等临床研究中,推动生命科学和临床医学等多学科的发展。针对CRISPR系统在转化医学中的研究应用进行阐述。

基因组编辑技术的发展及其在基因治疗研究中的应用

基因组编辑技术是指在基因组的特定位点进行序列修改的技术,对于基因功能的研究、基因组学的研究、精准基因治疗都具有重要的意义。本文综述了三代基因编辑技术锌指核酸酶、转录激活因子样核酸酶以及CRISPR/Cas9系统的原理、特点以及应用,并比较了三个技术之间的相同点和差异,以及应用的优劣势。最后,列举了基因组编辑技术在基因治疗研究中的应用举例。

新的机遇和挑战

微生物的获得性免疫系统与基因编辑: 2018年,“基因编辑”这一专业术语随着“露露”和“娜娜”一对基因编辑婴儿的诞生飞入了寻常百姓视野,引起了社会热议。借助于基因编辑技术,基于序列特异性可进行靶向性基因敲除、特异突变位点导入及定位转基因等基因组编辑。基因编辑技术包括CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术,可高效、定点地进行基因组编辑。