骨髓间质干细胞移植治疗DKO鼠后肌组织的超微结构改变

目的观察Duchenne型肌营养不良症模型DKO小鼠经骨髓间质干细胞(MSC)移植治疗后肌组织的超微结构改变情况。方法用体外培养纯化的第五代SD大鼠MSC经尾静脉移植治疗DKO鼠,在移植后15 w取鼠后肢腓肠肌组织进行透射电镜超微结构的观察。结果传5代后的MSC均一性好,免疫源性低;移植治疗后DKO鼠的运动功能有所改善,生存时间也有延长。肌组织的超微结构观察发现,肌细胞膜断裂、膜下组织分离水肿、核中移、局部肌原纤维松散、炎症细胞浸润和结缔组织增生等病变情况较对照鼠有改善,并出现肌膜下多个幼稚核融合现象。结论MSC具有强大的可塑性,通过血循环可趋向病变肌组织并参与鼠肌萎缩组织的修复与再生作用。

骨髓干细胞移植对dystrophin/utrophin基因双敲除鼠骨骼肌微观结构的影响

【目的】研究骨髓干细胞移植对Duchenne型肌营养不良(DMD)鼠(dko鼠)的骨骼肌微观结构的影响。【方法】获取4～5周龄C57BL/6鼠骨髓干细胞,体外培养3d,以1.2×107个细胞/只静脉移植到7Gyγ射线预处理的6只dko鼠(7～8周龄)。8周后,检测移植鼠肌肉组织dystrophin蛋白表达、显微以及超微结构改变,并比较两组生存期。【结果】6只dko鼠骨髓干细胞移植8周后,约有7%骨骼肌肌纤维表达了dystrophin蛋白,骨骼肌组织的显微及超微结构有了一定的改善,治疗组生存期有明显延长。【结论】静脉移植同种、同系鼠骨髓干细胞的dko鼠,8周之后,部分骨骼肌细胞有缺失蛋白的表达、其微观病理变化有了一定改善,生存期得到延长;提示干细胞移植治疗DMD有效。

骨髓间质干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症模型鼠后运动功能的改善

目的观察骨髓间质干细胞(MSC)移植治疗假肥大型肌营养不良症(DMD)动物模型dko鼠后运动功能的改善情况。方法用体外培养传代扩增纯化的第5代(P5)MSC经鼠尾静脉移植治疗dko鼠,在细胞移植治疗后15周分别对实验组与对照组dko鼠进行牵引、转棒、转轮、倒挂、翻身、走步的一系列运动功能测试观察(录像记录),并取dko鼠后肢腓肠肌组织做荧光免疫组化检测抗肌萎缩蛋白(dystrophin/utrophin)的表达,计算阳性肌纤维的平均吸光度值并进行统计学分析。结果传3代以上呈集落生长的MSC均一性好,静脉移植免疫反应低,移植后15周实验组dko鼠肌膜组织有dystrophin/utrophin免疫荧光表达,而对照组则无免疫荧光表达,两组有显著差异(P<005);MSC移植后15周实验组dko鼠的系列运动功能测试均显著优于对照鼠(P<005)。结论MSC移植对dko鼠肌萎缩组织有一定的修复与再生作用,并能改善DMD模型鼠的主动与被动运动功能。

Duchenne型肌营养不良症模型鼠的研究

目的 系统研究 C5 7鼠、mdx鼠、dystrophin/ utrophin基因双敲除 (dko)鼠运动功能、生化、病理等方面的差异 ,为假肥大型肌营养不良症 (DMD)的进一步研究提供可靠依据。方法 取 8～ 9周龄的 C5 7鼠、m dx鼠、dko鼠 ,对其做运动生理测定以及血肌酸激酶 (CK)、肌肉组织病理、肌肉组织免疫组化检测。结果 dko鼠的 3min牵引实验坠落次数、10 min转棒实验坠落次数以及血清 CK分别为 15 .83± 3.0 6、10 .83± 2 .6 4和 15 70 .5 0±2 37.79(U / L ) ,与 C5 7鼠的 4 .33± 2 .73、1.83± 1.33和 2 33.83± 77.4 5及 mdx鼠的 3.6 7± 2 .73、1.33± 0 .6 7和86 8.17± 12 7.92比较 ,其检测结果均有显著差异。 m dx鼠与 C5 7鼠比较 ,病理、生化有差异 ,运动功能无差异。结论dko鼠与 m dx鼠比较 ,病情重 ,更接近 DMD的疾病特性 ,是研究

骨髓干细胞移植改善dystrophin^(-/-)/utrophin^(-/-)鼠运动功能

目的 研究骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠(dystrophin/utrophin gene double knock-outmice,dko鼠)的运动功能改善情况。方法 获取4～5周龄C57BL/6鼠的骨髓干细胞,体外培养3 d,以1.0×10~7/只静脉移植到经7Gy γ射线预处理的dko鼠(7～8周龄)。8～9周后,检测移植鼠运动功能、肌电图及肌肉组织dystrophin蛋白表达情况。结果 骨髓干细胞移植8～9周后,11只dko鼠牵引运动坠落次数为(3.09±2.47)次,与对照组(非移植组)dko鼠(16.78±3.6)次比较,有显著性差异;肌电图指标中,动作电位时限和最大收缩电位波幅分别为(4.99±1.62)ms,和(2872±1474.33)μV,与对照组(3.69±0.40)ms和(1210.00±551.00)μV比较,有显著改善;其肌肉组织有7％肌纤维表达了dystrophin蛋白。结论 静脉移植同种、同系鼠骨髓干细胞后,dko鼠的运动功能、电生理有了显著改善;其部分骨骼肌细胞有缺失蛋白的表达。提示干细胞移植治疗DMD有较理想的前景。

Duchenne型肌营养不良小鼠模型鉴定及干细胞移植后dystrophin的变化

目的建立Duchenne型肌营养不良(DMD)模型dko小鼠的鉴定方法,评估干细胞移植后dystrophin的再生水平。方法采用SSP-PCR方法鉴定杂合子鼠交配产生的子代鼠的基因型。生化分析仪测定dko小鼠血浆肌酸激酶含量,HE染色观察肌肉组织学变化。扩增人脐带间充质干细胞并注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生三个基因型的子代鼠,21.2%的子代鼠可以鉴定为dko小鼠的基因型(285 bp)。dko小鼠显示了肌营养不良的症状,血浆肌酸激酶含量高达(16,988.52±617.48)IU/L,典型的病理变化包括肌纤维大小不一,多见核中移细胞,结缔组织增生或炎性细胞浸润。将人脐带间充质干细胞注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后可检测到人dystrophin的表达。结论采用SSP-PCR可用于鉴定dko小鼠基因型,dko小鼠是研究干细胞治疗DMD的理想动物模型。

DMD模型鼠基因型鉴定及其肌组织病理学与超微结构研究

目的:探讨DMD动物模型dko小鼠的基因型鉴定方法及其肌组织的病理学与超微结构情况。方法:运用序列特异性引物PCR-SSP技术鉴定杂合子种鼠的子代基因型,并对子代dko小鼠的骨骼肌组织冰冻切片进行HE染色和dystrophin/utrophin的SABC-Cy3荧光免疫组织化学检测以及肌组织的透射电镜观察。结果:112只子代鼠中,mdx小鼠28只,dko小鼠26只,杂合子鼠58只,按百分比计算,分别占25.0％、23.2％、51.8％,基因型鉴定结果符合孟德尔遗传规律;dko小鼠肌组织HE染色显示细胞大小形态不均,轮廓变圆,核中移,肌间隙变宽,有炎症细胞浸润与结缔组织增生现象;免疫荧光检测肌膜未见有dystrophin/utrophin表达;电镜观察有肌膜断裂不完整、膜与膜下组织分离并水肿、肌原纤维结构松散、结缔组织增生及炎症细胞浸润等现象。结论:PCR-SSP技术鉴定子代鼠基因型快捷准确;dko小鼠的病理生理学表现与DMD极为相像,是DMD临床治疗研究的理想疾病动物模型。

presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠的寿命观察

目的观察Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠(dKO mice)的生存曲线,为进一步繁殖及使用该模型对阿尔茨海默病(AD)进行研究提供实验设计等提供参考。方法将dKO mice雌性50只,雄性30只,及野生型同系小鼠雌、雄各20只分为4组,观察正常喂养情况下4组间小鼠2年以内各自的生存情况及寿命,绘制生存曲线进行生存分析。结果 dKO mice随着时间的延长,雌、雄性生存概率分别低于野生型雌、雄性小鼠,差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.001;P<0.001;P<0.001);dKO mice雌、雄性之间的生存概率差异无统计学意义。结论条件性敲除presenilin-1与presenilin-2双基因可能会缩短小鼠的寿命,其生存概率显著低于野生型小鼠,而dKO mice雌、雄性之间的生存概率则无统计学差异。本实验结果可为借助此模型的实验设计应用提供有益参考。

阿尔茨海默病小鼠模型海马组织Atp5a1基因甲基化改变

目的初步探讨中期阿尔茨海默病(AD)的presenilin-1/presenilin-2双基因条件性敲除小鼠(d KO mice)模型中海马组织Atp5a1基因的甲基化改变情况。方法运用简化的表观亚硫酸盐测序技术(RRBS)检测3只12月龄雌性d KO mice和3只同系同龄雌性野生型小鼠海马组织基因组DNA异常甲基化情况,利用Bismark(v O.7.4)软件进行对照分析获取异常甲基化基因。结果二代测序结果显示12月龄中度神经退行性病变AD d KO mice海马中Atp5a1基因呈低甲基化状态(P<0.05)。结论 Atp5a1基因在中期AD d KO mice的海马中呈低甲基化状态,提示低甲基化的Atp5a1基因可能作为参与中期AD病程的潜在候选基因。

Utrophin+/-mdx鼠子代的基因型鉴定

[目的]对utrophin基因+/-mdx鼠(简称杂合子鼠)的子代进行基因鉴定。[方法]从杂合子鼠子代鼠尾提取DNA,对其正常和异常的utrophin基因片段扩增,电泳后观察结果。[结果]27只杂合子鼠子代鼠中,鉴定出7只mdx、14只杂合子、6只dystrophin/utrophin基因双敲除鼠,依次约占总数的1/4、1/2和1/4。[结论]本实验方法能够精确鉴定出mdx、杂合子和dko鼠,为DMD进一步的实验研究提供了有效的手段。

组氨酸磷酸酶LHPP是一种肿瘤抑制蛋白

【据《Nature》2018年3月报道】题：组氨酸磷酸酶LHPP是一种肿瘤抑制蛋白（作者Sravanth K H等） Sravanth等通过特异性敲除肝脏PTEN、TSCl双基因进而激活roTOR的方法构建L—dKO小鼠肝癌模型。通过对L-dKO小鼠获得的12个肿瘤组织进行蛋白质组学定量分析，发现唯一已知的组氨酸磷酸酶NMEl、NME2表达上调。然而，一种未知的LHPP蛋白在肿瘤中的表达水平却明显下调。文章旨在研究LHPP蛋白在肝癌发生发展中的作用。

阿尔茨海默病presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠海马Ptprd基因甲基化改变

目的探讨Ptprd基因在中期阿尔茨海默病小鼠模型(presenilin-1/presenilin-2条件性双基因敲除小鼠,d KO小鼠)海马组织甲基化改变情况。方法取12月龄雌性d KO小鼠3只和12月龄雌性CBAC57小鼠3只分别作为实验组和对照组,采用第二代高通量测序技术(简化的代表性亚硫酸氢盐测序,RRBS)检测其小鼠海马组织基因组DNA,然后将测序后的结果过滤并用Bismark(v O.7.4)软件进行比对分析以获取异常甲基化基因。结果二代高通量测序法筛选出的Ptprd基因在中期阿尔兹海默病程中呈低甲基化改变(P<0.05)。结论在中期AD d KO小鼠模型中可能出现了Ptprd基因低甲基化,低甲基化Ptprd基因可能与AD的中期病程有关。

中期阿尔兹海默病presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠海马Vps33b基因的甲基化改变

目的:探讨中期阿尔兹海默病的presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠(dK O小鼠)模型海马中Vps33b基因甲基化改变情况。方法:采用简化的表观亚硫酸盐测序技术(RRBS)检测12月龄雌性dK O小鼠和同龄雌性野生型小鼠各3只海马组织基因组DNA异常甲基化改变情况,利用相关生物软件对照分析获取异常甲基化基因,并通过重亚硫酸盐甲基化测序技术进行相应验证。结果:RRBS法筛选出Vps33b基因在中期阿尔兹海默病dK O小鼠海马中呈高甲基化状态,经重亚硫酸盐单基因测序验证Vps33b基因为高甲基化,与RRBS检测结果一致。结论:Vps33b基因在中期AD dK O小鼠海马中呈高甲基化状态,提示高甲基化的Vps33b基因可能与中期阿尔茨海默病病程相关。

中期PS1/PS2双基因敲除小鼠模型海马组织中Hnf4a基因甲基化改变

目的初步分析中期Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除的阿尔茨海默病小鼠模型(PS1/PS2 dKO mice)海马组织中Hnf4a基因甲基化变化。方法应用简化表观亚硫酸氢盐测序技术(RRBS)检测分析3只12月龄雌性PS1/PS2 dKO mice海马组织基因组DNA甲基化状态的改变,3只12月龄雌性同系野生型小鼠作为对照,利用相应生物软件分析结果,获得异常甲基化状态的基因。结果 RRBS甲基化测序结果显示中期阿尔茨海默病PS1/PS2 dKO mice模型海马组织中Hnf4a基因呈现高甲基化状态(P<0.05)。结论 Hnf4a基因在中期阿尔茨海默病小鼠模型中的高甲基化状态提示该基因的高甲基化可能参与到了阿尔茨海默病的病程当中。

中期阿尔茨海默病小鼠模型海马组织Mst1r基因甲基化初探

目的探讨Mst1r基因在中期病程阿尔茨海默病模型(presenilins条件性双基因敲除小鼠,d KO mice)中海马组织的甲基化状态。方法选取12月龄雌性d KO mice及同系野生型小鼠各3只,采用二代测序技术(简化表观亚硫氢酸盐测序技术,RRBS)检测其海马组织基因组DNA以获得甲基化异常基因。结果RRBS测序成果显示中期AD d KO mice海马组织中Mst1r基因呈超甲基化状态(P<0.05)。结论超甲基化的Mst1r基因可能在中期AD d KO mice的病理过程中发挥着一定作用。

2种Gal抗原缺失小鼠的免疫学特性比较研究

目的:考察2种Gal抗原缺失小鼠对外来抗原刺激的免疫应答特性,分析其用于Gal抗原阳性材料免疫毒性评价的敏感性。方法:采用外来Gal抗原(兔血红细胞,RRBC)免疫刺激2种Gal抗原缺失小鼠(GGTA1单基因敲除,KO与GGTA1/iGb3S双基因敲除,DKO),比较分析经免疫刺激后2种小鼠的免疫应答特性和敏感性,包括:特异性抗-Gal抗体水平,与免疫排斥反应及炎症反应相关的细胞因子表达水平和脾脏淋巴细胞亚型分型比例。结果:GGTA1/iGb3S DKO小鼠经腹腔内RRBC免疫刺激2次后,血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM水平与未接受免疫刺激的小鼠相比,分别升高约41倍和184倍;同时,脾脏T细胞亚型标志物(CD3^+CD8^+)水平轻度增高。GGTA1 KO小鼠经RRBC免疫刺激2次后,血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM水平与未接受免疫刺激小鼠相比,分别升高约92倍和407倍;同时,脾脏B细胞亚型标志物(CD3^-CD19^+)水平轻度升高。然而,与GGTA1/iGb3S DKO小鼠相比,可能由于个体间差异较大,除了2次免疫后抗-Gal IgG在800倍稀释,抗-GalIgM在3 200倍稀释时略高之外,其他并不存在显著性差异。2种Gal抗原缺失小鼠在RRBC免疫刺激后的NK细胞亚型标志物水平及细胞因子(IFN-gama,IL-4与IL-12P70)表达水平未见明显变化。结论:2种Gal抗原缺失小鼠均对外来抗原刺激具有较强的敏感性,表现为特异性抗-Gal抗体的显著升高,然而,GGTA1/iGb3S DKO小鼠与GGTA1 KO小鼠相比,未表现出更高的敏感性。因此,作为异种免疫原的免疫学评价模型,GGTA1 KO小鼠和GGTA1/iGb3S DKO小鼠都是敏感的实验动物模型。本研究采用的RRBC预免疫方法既能够提升小鼠的抗-Gal抗体水平,又不引起显著的免疫毒性反应,为后期用于动物源性生物材料的免疫学评价实验动物模型的应用奠定了基础。

DMD动物模型研究

DMD是一种致死性的遗传性肌病,目前已经建立的动物模型包括mdx和dko鼠、GRMD狗、HFMD猫、斑马 鱼及C.elegans线虫,各种模型有不同的分子基础和病理特点。在DMD发病机制和治疗方法的研究中,应用鼠和 狗模型最广泛,但是斑马鱼和线虫因为容易繁殖、基因简单也正日益受到关注。