TdT介导dUTP缺口末端标记技术检测肝细胞癌凋亡

应用ＴｄＴ介导ｄＵＴＰ末端标记（ＴＵＮＥＬ）技术检测了３０例肝细胞凋亡病变，均见不同范围的阳性：单个癌细胞阳性１４例；点状阳性７例；小片状阳性６例；大片状阳性３例。偶见胞浆阳性。该技术快速、简便、灵敏、特异。

改进dUTP缺口末端标记技术法的操作体会

通过对多种石蜡组织切片运用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测细胞凋亡,在进行前期处理、冲洗、减少非特异性染色、蛋白酶K消化时间、显色、复染、封片等方面总结了一定经验。

原位缺口末端标记法检测人胚胎脊髓发育过程中细胞凋亡的表达及意义

目的探讨人胚胎发育早期脊髓内细胞凋亡的变化规律。方法应用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测和图像分析(NIS-DR)软件测量第2、3、4三个月龄段,人胚胎脊髓组织中凋亡细胞的积分光密度(IOD)值,数据的组间比较采用单因素方差分析。结果第2、3、4三个月胎龄段,人胚胎脊髓中央管、前角和后角处均有凋亡细胞存在。2个月胎龄组脊髓组织中,TUNEL阳性细胞的IOD值为134.9954±10.5326(n=4),3个月组IOD值为149.0331±5.6619(n=5),4个月组IOD值为140.7892±7.6532(n=5),可见IOD值有先升高后降低的趋势,三组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论细胞凋亡在人胚胎脊髓的生长发育过程中起重要的调节作用。

应用缺口末端标记法(TUNEL)分析犬瘟热病毒(CDV)诱导的细胞凋亡

利用犬瘟热病毒 (caninedistempervirus,CDV)弱毒标准株OP CDV感染敏感细胞系非洲绿猴肾细胞 (Vero) ,应用缺口末端标记法 (TdT mediateddUTPnickendlabeling ,TUNEL)分析感染细胞的凋亡。结果在感染后 48h的Vero细胞中检出了凋亡阳性细胞 ,而对照细胞内未检测到凋亡细胞。感染后 2 4h的细胞尚未出现细胞病变 ,这一时期的细胞内也未检测到凋亡细胞。表明CDV能诱导细胞调亡 ,且凋亡细胞的检出时间与细胞病变的出现时间呈正向相关。

电镜下人胎盘滋养细胞的凋亡形态及其DNA缺口末端标记的对比研究

目的 :本文提出胎盘滋养细胞结是 Keer描写的凋亡小体以外的另一种凋亡形态。方法 :用电镜系统地观察 :人胎盘滋养细胞生长、发育和衰老 ,并进一步用 DNA缺口标记做了对比观察。结果 :合体细胞结终末超微结构符合细胞凋亡形态特征。讨论 :胎盘滋养细胞凋亡从分子水平开始至超微结构及细胞形态变化是一个发展过程。

不同制动时相兔骨骼肌萎缩与细胞凋亡的实验研究—原位缺口末端标记法(TUNEL)的观察检测

探讨制动后骨骼肌萎缩的发生机制与骨骼肌细胞凋亡的关系。按照 Sievanen法制备不同时相的制动实验组 ,2 4只实验兔随机分为 4组 ,每组 6只 ,实验侧用管形石膏固定 ,自身未固定侧做对照组。在制动后 3、7、14和 2 8d取材 ,应用末端转移酶介导的 U TP缺口末端标记法 (Td T— mediated d UTP nick end labeling,TUNEL )检测萎缩骨骼肌中有无凋亡的骨骼肌细胞 ,并与形态学的观察结果相对照。对各组的数据进行统计学处理。结果表明不同制动时相所致的萎缩骨骼肌中均可发现有程度不一的骨骼肌细胞发生凋亡 ,以 14 d组最为显著。不同时相凋亡的肌细胞在空间的分布上呈不一致性。制动所致萎缩的骨骼肌中有时可见呈假阳性 TU NEL染色 ,但与凋亡的肌细胞的表现是不同的。我们认为 (1)制动后骨骼肌萎缩有骨骼肌细胞凋亡的参与。 (2 )骨骼肌细胞凋亡的多少与制动时相密切相关 ,以制动后 14 d最为明显。 (3)凋亡的骨骼肌细胞在空间分布上随制动时相不同而不同 ,呈不一致性。 (4 )制动后骨骼肌萎缩的程度与肌细胞凋亡的程度密切相关。

生物工程技术讲座(十) 核酸标记—生物探针法

在核酸的研究中不用放射性同位素,而用生物素(biotin)标记DNA或RNA分子做为探针来检测核酸分子的方法,是最近几年内开展起来的实验新技术。按一般常规在进行核酸的分析、鉴定以及分子杂交等实验之前.

聚肌苷酸聚胞苷酸对高血脂大鼠脑缺血/再灌注后Bcl-2和Bax表达的影响及神经保护作用

目的观察聚肌苷酸聚胞苷酸(Poly-IC)处理对高血脂大鼠脑缺血/再灌注(I/R)损伤后Bcl-2和Bax表达的影响,同时检测脑梗死灶、血脑屏障通透性和行为损伤症状,探讨其对高血脂合并脑I/R损伤是否发挥神经保护作用。方法高血脂大鼠随机分为脑I/R组、Poly-IC预处理组、Poly-IC后处理组和假手术(Sham)组,每组20只。0~4分神经行为评分记录各组大鼠的神经行为表现,伊文思蓝染色法检测各组大鼠血脑屏障通透性,TTC染色法观察各组大鼠脑组织梗死情况,TUNEL染色法测神经细胞的凋亡情况,Western blotting观察Bcl-2和Bax相对表达水平。结果与sham组比较,I/R组神经行为损伤症状严重,评分明显升高(P<0.05)。而Poly-IC预处理和后处理组评分较I/R组均明显降低(P<0.05)。伊文思蓝染色结果显示,I/R组较sham组血脑屏障通透性明显增高(P<0.05),而Poly-IC预处理或后处理可明显改善血脑屏障通透性(P<0.05)。脑梗死体积检测结果显示,sham组未见梗死灶均匀红染,而I/R组脑组织可见白色梗死区。与I/R组比较,Poly-IC预处理和后处理组梗死灶体积均明显缩小(P<0.05)。I/R组大鼠大脑皮质内细胞凋亡指数较sham组显著升高(P<0.05),而Poly-IC预处理和后处理组大鼠大脑皮质内细胞凋亡指数较I/R组均明显降低(P<0.05)。与sham组比较,I/R组Bax表达明显升高(P<0.05),Bcl-2表达明显降低(P<0.05)。与I/R组比较,Poly-IC预处理和后处理组Bax表达均明显降低(P<0.05),Bcl-2表达明显升高(P<0.05)。结论Poly-IC预处理或后处理可改善神经行为损伤症状,减轻血脑屏障损害,缩小脑梗死体积,降低神经细胞凋亡指数,对高血脂大鼠脑I/R损伤起到神经保护作用;该保护作用可能与Bcl-2和Bax表达水平改变有关。

瑞芬太尼预处理对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及Bcl-2 Bax表达的影响

动物实验研究表明，瑞芬太尼预处理可模拟缺血预处理效果，诱导脑缺血耐受的产生。但瑞芬太尼能否通过影响脑I／R后神经细胞凋亡途径而起到脑保护作用，尚不清楚。作者利用不完全脑缺血再灌注损伤模型。采用免疫组织化学方法及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）法．观察瑞芬太尼预处理对脑I／R大鼠神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响，探讨其对脑I／R损伤的保护机制。

骨髓间充质干细胞移植可促进移植胰岛周围新生血管形成

目的探讨胰岛移植联合骨髓间充质干细胞(MSC)移植能否促进移植胰岛周围新生血管形成。方法以非肥胖糖尿病(NOD)小鼠作为受体,将NOD小鼠随机分为4组,联合移植组(6只)、单独胰岛移植组(6只)、单独MSC移植组(6只)、假性移植组(3只)。观察各组NOD小鼠移植后血糖和存活率的变化;采用5-乙炔基-2’脱氧尿苷(Ed U)及d UTP缺口末端标记(TUNEL)方法,在胰岛移植后1、2、4周检测单独胰岛移植组和联合移植组移植胰岛的增殖与凋亡情况;采用光学显微镜(光镜)直接观察、组织化学及免疫组织化学的方法观察并定量分析,移植术后2、4、8周单独胰岛移植组和联合移植组移植胰岛的周围新生血管密度。结果 MSC联合移植与胰岛单独移植均能明显改善移植后小鼠的血糖水平,提高NOD小鼠的存活率。MSC联合移植可促进胰岛细胞再生,减少细胞凋亡。联合移植组移植胰岛周围血管密度明显大于单独胰岛移植组。结论 MSC可以促进移植胰岛周围新生血管生成,增加移植胰岛的血供,保护移植胰岛的功能与活性。

脑膜瘤细胞凋亡的意义及其检测方法的比较

目的 探讨脑膜瘤细胞凋亡的意义,分析TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)、流式细胞术(FCM)和透射电镜3种检测方法的优缺点。方法 应用TUNEL、FCM检测47例脑膜瘤的凋亡指数(AI),同时用透射电镜观察其中15例凋亡细胞的超微结构改变。结果 经TUNEL和FCM检测,不典型及恶性脑膜瘤的AI高于良性脑膜瘤,复发组AI高于非复发组。经FCM检测的凋亡指数高于TUNEL法检测结果,二者呈正相关。透射电镜也证实了凋亡细胞的超微结构改变。结论 细胞凋亡是脑膜瘤的一种重要生物学特征,它与肿瘤的不典型或恶性改变以及预后有关,检测AI有助于判断脑膜瘤的复发倾向。TUNEL和FCM用于凋亡的定量检测,FCM的敏感性高于TUNEL,而透射电镜是凋亡定性的可靠方法。

白介素12诱导T细胞凋亡的作用

目的 :探讨白介素 12 (IL - 12 )对T细胞凋亡的作用。方法 :用dUTP缺口末端标记(TUNEL)和AnnexinV的方法测定IL - 12诱导后T细胞凋亡率。结果 :IL - 12诱导人的白血病T细胞株TIB - 15 2和人的淋巴瘤T细胞株HTB - 176的凋亡 ,以 5 0ng/mL的质量浓度作用效果最佳 ,作用时间在 3和 6d内达到最高峰。结论 :IL - 12能诱导T细胞的凋亡 ,其诱导作用从细胞早期质膜的改变开始 ,并与IL - 12的浓度和T细胞成熟状态及作用时间有关。

乳腺癌组织中p51基因的表达及其意义

背景与目的:研究p51基因与乳腺癌的关系。材料与方法:应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminaldeoxynucleotidyltransferasebiotin-dUTPnickendlabeling,TUNEL)、RT-PCR等技术检测乳腺癌组织p51基因的表达及其与细胞凋亡、激素受体的关系。结果:乳腺癌(45例)组织p51基因表达(46.7%)高于良性乳腺病变(35例)组织(11.4%);淋巴结转移阳性者p51基因表达(90.5%)明显高于阴性者(8.3%);p51基因表达与雌激素、孕激素受体无相关性(P>0.05);p51基因表达阳性的肿瘤细胞凋亡率与阴性细胞差异无统计学意义(P>0.05)。结论:P51基因表达增多可能与乳腺癌发病及转移有关。

大鼠肺移植供肺保存过程中细胞死亡类型的动态变化

目的通过对供肺保存过程中细胞凋亡和细胞坏死的动态变化的研究,探讨建立一种可以准确评估供肺保存质量的实验模型。方法清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠42只,体重250～300g,预先分为7组,每组6只。整体获取心肺,置于4℃的新鲜制备的低钾右旋糖酐（LPD）溶液中保存。保存不同的时间（0、2、4、6、12、18、24h）后,通过主肺动脉向肺内灌注20mL的500mmol/L锥虫蓝、20mL生理盐水和10mL4%的多聚甲醛后固定,蜡块包埋后按4μm层厚切片。在光学显微镜下观察锥虫蓝染色情况;另一方面作TUNEL染色和Hoechst染色,在荧光显微镜下观察,严格按照盲法原则由两位研究者对死亡细胞进行分类计数。结果随着供肺低温保存时间的延长,细胞死亡数量上逐渐增加,而且细胞的死亡类型上发生动态变化。在低温保存的条件下,4h组才开始有少量的坏死细胞出现,随着保存时间的逐渐延长,细胞坏死也逐渐增加,在供肺保存18h以上组,坏死细胞显著增加;而细胞的凋亡开始于供肺保存2h组,在供肺保存12h组达到高峰,约占所有细胞的9%,在供肺保存18h组基本消失。结论通过对不同保存时间的供肺进行锥虫蓝、TUNEL、Hoechst三染色的方法,能很好的显示供肺保存后的细胞凋亡和坏死的情况。

血管生成和细胞凋亡在鼻咽粘膜上皮癌变中的作用

细胞凋亡(apoptosis)是一种程序性细胞死亡,是由基因控制的一种不同于坏死的细胞死亡方式,已证实细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫疾病以及组织细胞数量的恒定发挥重要作用。最近研究也发现,细胞凋亡也与肿瘤的发生发展密切相关。同样,已有明确证据表明,肿瘤的生长、浸润及转移也依赖于肿瘤的血管生成。但目前并不知道细胞凋亡、血管生成在鼻咽粘膜上皮癌变中发挥什么作用,两者在肿瘤中的相互关系也知之甚少。

胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤的干预作用

目的研究胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。方法应用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)模型,经尾静脉注射胡黄连苷Ⅱ(10mg/kg)和丹参素钠(10mg/kg)干预治疗,Bederson法评价动物的神经行为功能,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死体积,组织病理学观察神经细胞结构,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果脑缺血再灌注损伤后,大鼠均表现神经行为功能障碍,缺血侧出现脑梗塞病灶,神经细胞凋亡数量均高于假手术组。胡黄连苷Ⅱ和丹参素钠治疗后,神经细胞凋亡数量明显减少、脑梗塞体积显著缩小,动物神经行为功能明显改善,与模型对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。胡黄连苷Ⅱ组脑梗塞体积显著小于丹参素钠组(P<0.05)。结论胡黄连苷Ⅱ可能通过抑制细胞凋亡,缩小梗死体积而改善大鼠的神经行为功能。

运动性蛋白尿与肾脏细胞凋亡及氧自由基代谢关系的研究

目的 :观察大鼠不同强度运动后肾脏细胞凋亡及氧自由基变化与运动性蛋白尿之间的关系 ,以期进一步阐明运动性蛋白尿的发生机制。方法 :36只雄性SD大鼠随机分为安静对照组、中等强度运动组和大强度运动组。运动后 2小时取材 ,采用原位缺口末端标记 (TUNEL)和流式细胞术分别检测大鼠肾脏凋亡细胞及Bax、Bcl- 2基因的表达 ;同时检测大鼠肾脏组织超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH -Px)、丙二醛 (MDA)含量及运动后各实验组大鼠尿蛋白含量。结果 :运动后大强度组肾脏凋亡细胞显著增加 ,凋亡调控基因Bax/Bcl - 2比值上升 (P <0 0 1) ,尿蛋白含量显著升高 ,反映肾脏组织细胞抗氧化能力的SOD及GSH -Px活性显著下降 ,而MDA含量显著升高。结论 :大强度运动造成肾脏细胞凋亡及氧自由基增加可能参与了运动性蛋白尿的发生过程。

穴位埋线对血管性痴呆大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的影响

目的观察穴位埋线疗法对血管性痴呆(VD)大鼠海马CA1区神经细胞凋亡和Bcl-2 mRNA及Bax mRNA表达的影响,探讨穴位埋线对VD大鼠脑缺血性损伤的神经保护机制。方法采用改良Pulsinelli’s 4血管阻断法建立VD大鼠模型,随机数表法分为VD模型组、穴位埋线组、尼莫地平组,并设置假手术组作为对照。两个治疗组分别施行穴位埋线和尼莫地平治疗。Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力后,取含海马的脑组织,TUNEL法检测海马CA1区神经细胞凋亡,原位杂交法检测其Bcl-2 mRNA及Bax mRNA表达,观察并比较各组大鼠海马神经细胞凋亡、蛋白表达的变化。结果 VD模型组大鼠海马CA1区可见大量凋亡细胞、Bcl-2 mRNA表达降低、Bax mRNA的表达增高,与假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。VD模型组表现出明显的学习记忆障碍,与假手术组相比差异有统计学意义(P<0.01);与VD模型组比较,穴位埋线组大鼠学习记忆能力显著提高(P<0.01),CA1区凋亡细胞明显减少(P<0.01),可见一定数量的Bcl-2 mRNA阳性细胞表达,而Bax mRNA阳性细胞表达较少。结论穴位埋线可通过上调VD大鼠海马CA1区Bcl-2 mRNA的表达、下调Bax mRNA的表达,抑制海马神经细胞凋亡,改善VD大鼠学习记忆能力。

玉米CMS-S小孢子败育过程中的细胞程序性死亡

以玉米(Zea maysL.)S型细胞质雄性不育系(CMS-S)的1对近等基因系S-Mo17Rf3Rf3和S-Mo17rf3rf3为材料,采用TdT介导的dUTP DNA末端标记(TUNEL)、细胞色素C免疫原位杂交和DNA寡聚核小体片段电泳等方法,分别在细胞学水平和DNA水平上研究了玉米CMS-S小孢子败育的细胞程序性死亡(PCD)过程。结果表明,在花粉母细胞减数分裂后的四分体解离时期,不育花药的绒粘层细胞较可育花药提前裂解;在不育系S-Mo17rf3rf3花药和花粉S-rf3中均明显出现PCD过程的DNA片段化以及线粒体细胞色素C外渗的现象,证明玉米CMS-S的花粉败育与花药绒粘层细胞的提前凋亡和小孢子细胞的程序性死亡有关。