血清AFP、AFP-L3、GP73及DCP在慢性乙肝和肝癌诊治中的价值分析

目的探讨血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、高尔基体73(GP73)及异常凝血酶原(DCP)在慢性乙肝及肝癌诊治中的临床价值。方法回顾性选取2022年1月至2023年3月在浙江大学医学院附属金华医院就诊的肝癌患者78例(肝癌组)、慢性乙肝患者90例(慢性乙肝组)为研究对象,另择同期在本院健康体检者70名作为正常对照组。采集研究对象清晨空腹静脉血检测血清AFP、AFP-L3、GP73及DCP。比较3组研究对象血清AFP、AFP-L3、GP73及DCP阳性率和水平;分析以上指标血清水平对肝癌的诊断效能;比较肝癌组患者手术前后以上指标的血清水平。结果3组研究对象血清AFP、AFP-L3、GP73及DCP阳性率与水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05),且血清GP73、DCP水平肝癌组>慢性乙肝组>正常对照组(均P<0.05)。AFP、AFP-L3、GP73与DCP诊断肝癌的AUC分别为0.745、0.916、0.753和0.785。其中AFPL3的AUC最大,最佳截断值为9.35%,灵敏度为0.859,诊断效能较高;AFP的最佳截断值为9.37 ng/mL,特异度最高为0.900,但其灵敏度较低为0.564。肝癌组患者手术后血清AFP、AFP-L3、GP73及DCP水平均较手术前降低(均P<0.05)。结论血清AFP、AFP-L3、GP73及DCP对慢性乙肝及肝癌有一定的辅助诊断价值,可能是肝癌患者术后预后的潜在预测指标。

小反刍兽疫病毒非结构蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定

为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。

小反刍兽疫病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种能准确、灵敏地检测小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的ELISA方法,通过诱导BL21(DE3)-pET-30a-PPRV N表达菌种获得PPRV N蛋白,将纯化的PPRV N蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得1株能够高效表达、稳定分泌和具有较好竞争效果的抗PPRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1G2)。以纯化的PPRV N蛋白为包被抗原,HRP标记的1G2单克隆抗体(1G2-HRP)作为竞争抗体,建立了小反刍兽疫病毒竞争ELISA(competitive ELISA,cELISA)抗体检测方法。经优化反应条件确定最佳抗原包被浓度为1.0μg/mL,待检血清最佳稀释条件为4倍稀释,1G2-HRP酶标抗体最佳工作浓度为250 ng/mL;当阻断率(PI值)小于42%,判定为抗体阴性;阻断率大于或等于42%,判定为抗体阳性。该方法最低可检测128倍稀释的PPRV抗体阳性血清,具有较高的敏感性;仅能检测PPRV抗体,与羊源常见病原和pET-30a-BL21(DE3)的抗体阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间变异系数均小于15%,具有良好的重复性。该方法与血清中和试验的阳性符合率为87.80%(95%CI:73.80,95.92),阴性符合率为94.95%(95%CI:88.61,98.34),总符合率为92.86%(95%CI:84.11,97.64),Kappa值为0.83(95%CI:53.10,112.50),具有较高的符合率。表明建立的ELISA方法在我国PPRV的流行病学调查、疫苗免疫效果评估方面具有良好的应用前景。

血清NFL、GFAP水平与帕金森病患者焦虑抑郁的相关性研究

目的探究血清神经丝轻链(NFL)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)与帕金森病(PD)伴焦虑抑郁的相关性。方法本研究共选取96例PD患者和38例健康对照,并根据汉密尔顿焦虑量表(HAMA)和汉密尔顿抑郁评定量表(HAMD)评估PD患者焦虑抑郁情况并进行疾病分组。运用超灵敏单分子阵列(Simoa)技术定量检测血清中NFL和GFAP含量。比较不同组间的NFL及GFAP水平,并通过Spearman相关性分析及Logistic回归分析探究NFL、GFAP与PD焦虑抑郁的相关性,最后通过ROC曲线确定GFAP水平对于PD伴抑郁的诊断价值。结果与健康对照组相比,PD伴或不伴焦虑抑郁患者中的NFL水平升高(P<0.001);与PD不伴抑郁或焦虑的患者相比,PD伴抑郁或焦虑患者中的GFAP水平升高(P<0.05)。PD患者血清GFAP水平与焦虑抑郁程度呈正相关(r=0.271,P=0.008;r=0.302,P=0.003)。调整混杂因素后,Logistic回归分析显示GFAP仍是PD是否伴发抑郁的独立危险因素(P=0.028)。ROC曲线显示GFAP诊断PD伴抑郁的曲线下面积为0.660。结论血清GFAP水平与PD焦虑抑郁有关,并且是PD伴抑郁的独立危险因素。

CAR、FAR、LDH、D-二聚体对间质性肺病合并病毒感染严重程度的预测价值

目的 评估C-反应蛋白/白蛋白比值(CAR)、纤维蛋白原/白蛋白比值(FAR)、乳酸脱氢酶(LDH)、D-二聚体对间质性肺病(ILD)合并病毒感染严重程度的预测价值。方法 选取2019年6月-2022年12月在承德医学院附属医院临床诊断为间质性肺病(ILD),病毒血清学IgM抗体阳性的49例患者为病例组并随机选取病毒血清学IgM阴性54例患者作为对照组,收集并分析它们的临床资料,实验室检查结果。结果 49例患者中最常见的单一病毒感染是乙型流感病毒,混合感染是甲型流感病毒+腺病毒+呼吸道合胞病毒;感染患者年龄较对照组大(P<0.05),咳嗽、咳痰、呼吸困难的比率较对照组高(P<0.05);感染患者CAR、FAR、LDH、D-二聚体、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原(FIB)、纤维蛋白原降解产物(FDP)高于对照组(P<0.05),治疗好转率、氧合指数、白蛋白(ALB)较对照组低(P<0.05);CAR、FAR、LDH、D-二聚体与炎症因子ESR、CRP呈正相关(P<0.05);与氧合指数呈负相关(P<0.05),ROC曲线显示联合四项指标有较高的曲线下面积(AUC=0.791),联合指标的AUC大于CAR(Z=2.323,P=0.020)、FAR(Z=2.062,P=0.039),但与D-二聚体(Z=1.876,P=0.061)、LDH(Z=1.182,P=0.237)差异无统计学意义。结论 感染患者CAR、FAR、LDH、D-二聚体明显升高,炎症反应剧烈,治疗效果不佳。

血清DCP、AFP、AFP-L3和HSP90α在原发性肝细胞癌诊断中的应用价值

目的:探讨血清异常凝血酶原(DCP)、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、热休克蛋白90α(HSP90α)检测在原发性肝细胞癌(HCC)诊断中的临床应用价值,为临床提供参考。方法:选取2021年10月—2022年6月安徽医科大学附属巢湖医院收治的64例原发性肝癌(PHC)患者作为研究对象,将其中50例HCC患者与同期就诊的30例失代偿期肝硬化患者、30例乙型病毒性肝炎患者及30例健康人群分为HCC组、肝硬化组、肝炎组及健康对照组,检测并比较分析所有研究对象血清DCP、AFP、AFP-L3、HSP90α水平。结果:HCC组血清AFP、AFP-L3、DCP、HSP90α水平及GALAD评分均较其他三组高,差异有统计学意义(H=39.885、28.618、57.601、46.252、85.734,P<0.05)。绘制ROC曲线,AFP、AFP-L3、DCP、HSP90α及GALAD评分的受试者工作特征曲线下面积(AUC)分别为0.804、0.680、0.883、0.838及0.936。GALAD评分联合HSP90α诊断的AUC最高,为0.940。AFP、DCP与HSP90α三者联合可将诊断敏感度提高至84.0%。HBV组AFP、DCP水平及GALAD评分均高于非HBV组,差异有统计学意义(Z=-2.251、-1.668、-2.288,P<0.05),两组AUC值最高者均为GALAD,分别为0.951、0.903。结论:HCC相关肿瘤标志物单项检测敏感性较低,联合检测可明显提高诊断敏感性和准确性,增加HCC筛查阳性率。

不同的脱蛋白方法用于螺旋藻多糖提取工艺的研究

对比了两种不同的脱蛋白方法(酶+Sevage法和三氯醋酸法)在螺旋藻多糖提取工艺中的应用。研究结果表明,不同的除蛋白方法不仅影响蛋白质的去除率和多糖的得率,而且所得到的螺旋藻多糖在组分、分子大小及单糖组成上存在较大差异。

适于双向电泳分析的苹果叶片蛋白质提取方法

为了探索适用于双向电泳（2-DE）分析的苹果叶片蛋白质提取方法,比较了三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法、二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法、Tris-HCl提取法和改良的Tris-HCl提取法等4种蛋白质提取方法。以7cm、pH3-10的线性固相pH梯度（immobilized pH gradient,IPG）胶条作为第一向电泳,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（12.5%的分离胶）作为第二向电泳,对提取物进行2-DE分离,采用银染显色。结果表明,上述4种方法在2-DE图谱上分别得到140,215,181和616个蛋白质点。其中以改良的Tris-HCl提取法得到的蛋白质点数最多,且背景清晰、图谱上没有明显的横纵条纹。为了进一步验证改良的Tris-HCl提取法的有效性,用18cm、pH3-10的线性IPG胶条和12.5%的分离胶对提取的苹果叶片蛋白质进行2-DE分离,考马斯亮蓝R-250染色,共检测到455个蛋白质点,其相对分子质量主要分布在14000-66000范围内,图谱背景清晰,再次证明应用该方法制备的样品适用于双向电泳分析,可用于苹果叶片的蛋白质组学分析。

大枣多糖脱蛋白方法的研究

以大枣多糖为对象,比较了多糖的多种脱蛋白方法。在实验比较的五种脱蛋白方法中,复合酶法效果最佳,用中心复合实验设计的方法,研究了不同工艺条件组合对多糖脱蛋白效果的影响,并得出脱蛋白效果最佳时的工艺条件为:蛋白酶浓度为5.3%、反应温度为55℃、反应时间为3.3h。

壳聚糖絮凝纯化香菇多糖的研究

研究了壳聚糖对香菇多糖提取液的沉降作用,考察了壳聚糖用量、沉降时间、溶液酸度对吸附色素、沉降蛋白质和多糖损失的影响,同时考察了壳聚糖对超滤膜分离初始膜通量的影响。实验结果表明壳聚糖对香菇多糖提取液中色素和蛋白质具有较好的絮凝沉降效果,当壳聚糖的用量为5.0mg/mL,絮凝沉降时间为40min,溶液pH为5.0时,60r/min的转速搅拌条件下,色素含量降低了约28%,蛋白质含量降低了42%左右,而多糖含量只损失8.9%左右,溶液粘度降低了11.8%,采用超滤分离时,经壳聚糖沉降的多糖溶液初始膜通量增加了14%左右。

脱脂、脱蛋白处理对板栗粉膨胀势的影响

【目的】比较3个品种群的24个主栽品种板栗粉膨胀势及其脱脂、脱蛋白处理后膨胀势变化的差异,分析板栗粉的主要物质组成与其膨胀特性的关系,为板栗粉加工产品的研制提供理论依据。【方法】采用冷冻干燥法制取板栗全粉,索氏提取法制取脱脂板栗粉,碱液沉淀法制取脱蛋白板栗粉,索氏提取法和碱液沉淀法制取脱脂脱蛋白板栗粉;采用吸水膨胀离心法测定系列板栗粉膨胀势,凯氏定氮法测定蛋白质含量,索氏提取法测定脂肪含量,蒽酮比色法测定淀粉含量。【结果】板栗全粉的膨胀势在不同品种之间以及不同品种群之间均存在差异,其中北方品种群板栗全粉膨胀势最低。脱脂处理对板栗粉膨胀势的影响相对较小。各品种板栗粉脱蛋白处理后膨胀势均显著升高,脱蛋白板栗粉膨胀势以及膨胀势的变化值均在品种间存在差异。脱脂脱蛋白处理使大部分板栗粉膨胀势显著升高,不同品种之间存在差异,且脱脂脱蛋白板栗粉膨胀势按照北方品种群、中间类型品种群和南方品种群的顺序依次降低,其中北方品种群和南方品种群之间差异显著。板栗粉中的淀粉含量、蛋白质含量和脂肪含量在各品种之间存在差异,淀粉含量与板栗粉膨胀势存在显著相关性。【结论】淀粉是影响板栗粉膨胀势的重要因素,板栗粉中的蛋白质和脂类物质的共同作用显著影响板栗粉的膨胀势特性。脱脂、脱蛋白处理使板栗粉膨胀势发生改变,脱脂处理对板栗粉膨胀势影响相对较小,脱蛋白处理使板栗粉膨胀势显著增加,这种变化趋势及变化量与品种密切相关,并在一定程度上具有地域分布特性。

桑椹与叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较试验

为建立适合于桑树蛋白质组研究的双向电泳技术体系,以桑品种"大10"的桑椹与叶片为材料,探讨了桑树蛋白质不同提取方法对凝胶电泳效果的影响。结果表明,改良酚提取法与常规的SDS提取法、尿素/硫脲提取法相比,电泳图谱清晰,分离效果良好,能检测到更多的蛋白质组分,适用于桑椹与叶片蛋白质IPG-IEF/SDS-PAGE双向电泳及SDS-PAGE电泳的样品制备。

醇变性大豆蛋白在物理改性条件下的溶出行为和机理

研究了超声波、高速剪切以及加热对醇变性大豆蛋白的溶出速率和溶出蛋白质分子质量分布的影响。常温下的溶出速率随时间延长而降低 ,超声波或高速剪切作用使溶出速率增加 ,其溶出物中的蛋白质主要以分子形式存在。加热至 90℃可以将溶出初速率明显提高 ,但随后很快降低 ;溶出物主要是分子质量较大的蛋白质聚集体。研究表明 ,超声波和高速剪切的增溶机理是增加醇变性大豆蛋白中可溶性蛋白质的扩散速率 ;加热增溶的机理是破坏分子间非共价键从而使不溶性蛋白转化为可溶性蛋白。

人支气管上皮组织癌变各阶段2-DE图谱及差异分析

背景与目的:支气管上皮细胞的癌变是一个多基因参与、多阶段的复杂过程,但癌变机理仍不清楚,应用蛋白质组学技术研究此过程有可能识别癌变相关蛋白质,对揭示肺鳞癌癌变机制具有重要的意义。本研究的目的是优化支气管上皮组织的蛋白质样品制备方法,建立人支气管上皮癌变各阶段组织的2-DE图谱并进行差异分析,为鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白质奠定基础。方法:收集、筛选人支气管正常上皮、鳞状上皮化生、不典型增生和上皮浸润癌组织标本。改良的脱氧胆酸-三氯醋酸(deoxycholate-trichloroaeticacid,DOC-TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质,应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各阶段组织的总蛋白质,凝胶经银染显色后,用ImageMaster2D软件分析图谱,比较差异表达蛋白质。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质指纹图谱(peptidemassfingerprint,PMF),然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质。结果:应用改良的DOC-TCA法提纯总蛋白质进行双向电泳,获得了分辨率高、重复性好的人支气管上皮组织的双向电泳图谱,支气管正常上皮、鳞状上皮化生、不典型增生和上皮浸润癌组织凝胶的平均蛋白质点数依次为1189.50±39.89、1227.

天麻多糖水提及脱蛋白工艺优化

目的:摸索天麻多糖水提和脱蛋白工艺条件,为天麻多糖提取纯化的工业化提供理论依据。方法:采用正交实验研究了温度、物料比、时间对天麻多糖(GPS)提取工艺的影响;对比了两种不同的脱蛋白方法(Sevag法和酶-Sevag法)在天麻多糖纯化工艺中的应用。结果:水提最佳工艺为物料比1∶40,浸提温度120℃,浸提时间3 h。酶-Sevag法相对于Sevag法除蛋白效果好,且多糖得率高。

家蚕滞育卵浸酸后易溶性蛋白的表达差异分析

探明浸酸解除家蚕卵滞育的关联蛋白,可为改进和提高蚕种的人工孵化技术提供理论依据。以经2.5℃冷藏45 d的家蚕品种"7.湘×9.芙"滞育卵为材料,采用双向凝胶电泳和图像分析技术,比较浸酸与未浸酸蚕卵易溶性蛋白的差异变化。在未浸酸蚕卵的双向电泳图谱中共检测到523个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点41个;浸酸卵共检测到526个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点44个。浸酸与未浸酸蚕卵能相互匹配的蛋白质斑点有482对,匹配率91.897%。经对比分析,浸酸活化后的蚕卵蛋白出现了一些特异性的蛋白质斑点,或某些蛋白质斑点在含量上出现了差异变化。

天女木兰种子蛋白双向电泳体系的建立

【目的】探索一套适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系,为研究其种子萌发过程中的蛋白表达差异奠定基础。【方法】比较蛋白的不同提取方法(酚提取法、三氯乙酸-丙酮-酚提取法、三氯乙酸-丙酮法和Tris-HCl法)、IPG胶条pH梯度(pH3～11NL、pH3～10和pH4～7)、裂解液中的尿素浓度(6,7,8,9mol/L)和分离胶浓度(10%和12.5%)等条件,对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响,筛选适宜的双向电泳条件。【结果】以Tris-HCl法提取种子蛋白,在IPG胶条pH为4～7、裂解液中尿素浓度为9mol/L、分离胶浓度为12.5%的条件下,可以获得分辨率高、背景清晰、重复性好的天女木兰种子蛋白双向电泳图谱。【结论】建立了适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系。

北方常绿阔叶木本植物叶片蛋白质双向电泳技术体系优化

以北海道黄杨为模型植物,比较了3种不同叶片蛋白质提取方法,并优化了双向电泳各个环节技术体系,进一步用5种北方常绿阔叶木本植物进行验证,以建立适合北方常绿阔叶木本植物蛋白质分析的双向电泳技术体系。结果表明：（1）采用改进的酚/SDS方法提取叶片蛋白质,用添加硫脲和磺基三甲基胺乙内脂3~10的裂解液裂解蛋白,使用24 cm固相pH梯度胶条,考马斯亮蓝染色蛋白上样量800μg,最多可得到分辨率高、重复性好的蛋白点912个;银染色蛋白上样量110μg,最多可得到分辨率高、重复性好的蛋白点587个。（2）用优化的技术体系对5种北方常绿阔叶木本植物进行分析,结果显示5种植物叶片蛋白质2-DE图谱均背景清晰,分辨率好,重复性较好（重复组的相似系数平均为68.60%）;5种植物平均可得到约371个清晰可重复的蛋白点,其中大叶黄杨、扶芳藤、北海道黄杨、金心黄杨和小叶黄杨的2-DE重复组蛋白点数目分别为346、407、353、352和399个。表明本研究优化的蛋白质提取以及双向电泳技术体系适用于对北方常绿阔叶木本植物叶片的比较蛋白质组学分析。

大豆雄性不育系与其保持系不同器官蛋白质比较

采用双向凝胶电泳技术对大豆质核互作雄性不育系NJCMS2A及其保持系NJCMS2B的种子、叶片和花药等不同器官蛋白质进行比较分析.结果显示,不育系NJCMS2A与其保持系NJCMS2B的花药2-DE图谱间存在较多差异表达蛋白点,种子2-DE图谱间仅有少量差异表达蛋白点,而叶片2-DE图谱间基本没有差异表达蛋白点.结果表明,不育基因表达具有时空性和器官特异性,与育性有关的蛋白主要在花药中表达.

橡胶树胶乳黄色体死皮相关蛋白的鉴定及分析

本实验通过双向凝胶电泳技术(2-DE)比较橡胶死皮树与健康树胶乳黄色体蛋白表达谱的差异,通过软件分析比较获得37个差异表达的蛋白点,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析后,搜索NCBInr数据库,结果表明,有11个蛋白点被成功鉴定,其中7个为未知蛋白,其余4个蛋白分别为chloroplast 23 kDa polypeptide of photosystem II、ATP synthase beta chain、NADP-dependent sorbitol-6-phosphate dehydrogenase和vitamin-b12 independent methionine synthase。这4个蛋白在死皮树中表达量均下调,可能在死皮发生过程中起着重要作用。本研究将为进一步阐明橡胶树死皮发生的分子机制提供理论依据。