家蝇抗菌肽Defensin基因同向串联表达载体的构建和鉴定

目的:构建家蝇抗菌肽Defensin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法:PCR法扩增家蝇抗菌肽Defensin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoRⅠ和NheⅠ位点,下游5′端带有NotⅠ和XbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T载体,利用pMD18-T载体的NdeⅠ位点和目的片断上的一对同尾酶(NheⅠ和XbaⅠ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Defensin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功。结论:该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defensin基因的哺乳动物细胞真核表达载体。把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defensin,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定。结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。所以,重组质粒pcr3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成。且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同。

家蝇抗菌肽Defensin基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的:研究家蝇抗菌肽Defensin cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达情况,并对表达产物的抗菌作用进行初步检测。方法:以Defensin基因为模板设计特异性引物,扩增在C端含6×His标签的Defensin开放阅读框序列,将此序列与真核表达载体pcDNA3.1(+)进行重组,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6。以阳离子脂质体LipofectamineTM2000为载体,对宿主细胞COS-7进行重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6和空载体pcDNA3.1(+)的转染,72h后收集细胞培养上清液,表达产物经His-Trap HP亲合层析柱分离纯化和Western blotting鉴定后,进行杀菌活性的初步检测。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6组细胞培养上清液的纯化物,行Western blotting得到了分子量大小约为10.0kD的单一目的条带,与预期相符;杀菌活性试验中发现:该纯化物对大肠杆菌E.coliK12D31具有一定的杀菌活性。结论:家蝇抗菌肽Defensin基因在宿主细胞COS-7中得到了正确表达。

家蝇Defensin基因原核表达条件的优化及其抑菌活性

目的优化家蝇Defensin基因原核表达条件,并初步研究其抑菌活性。方法 Defensin基因成熟肽被克隆入pGEX-4T-1原核表达载体中,构建重组质粒pGEX-4T-1/Defensin,并转化宿主菌后诱导表达,表达过程中对菌液起始浓度、IPTG浓度、诱导温度和时间进行优化。采用亲和层析法分离纯化融合蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况和分子量。用凝血酶切除谷胱甘肽标签,并通过体外抑菌实验检测其抗菌活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1/Defensin,目的基因能够在大肠埃希菌内高效表达,分子量为4 kD,与预期值一致,表达量约达40%。抑菌实验显示其对大肠埃希菌K12D31生长有一定的抑制作用。结论本实验为家蝇Defensin基因功能的深入研究奠定了工作基础。

家蝇抗菌肽defensin基因的克隆、原核表达纯化及抑菌、抑肿瘤活性鉴定

为研究家蝇防御素融合蛋白对肿瘤细胞K562有抑制作用，在GenBank中检索家蝇defensin基因，设计特异引物，在家蝇幼虫组织中提取RNA，并通过PCR扩增defensin基因成熟肽部分（Maturedefensin，MD），将该基因与原核质粒表达载体pGEX．6P-1进行重组，构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1／MD。通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21（DE3）感受态细胞中，经25℃IPTG诱导在大肠杆菌E．coliDH5u中表达。用GST—Sefinose亲和层析纯化蛋白，15％SDS—PAGE分析鉴定，可见相对分子量为约30kDa的特异性目的条带。运用琼脂孔穴平板扩散法测定表达产物的活性，得知纯化后的重组融合蛋白pGEX-6P-1／MD对大肠杆菌生长有一定的抑制作用，并首次证明家蝇防御素融合蛋白pGEX．6P．1／MD对肿瘤细胞K562有抑制作用。家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1／MD被成功克隆和表达，证明纯化融合蛋白pGEX-6P-1／MD对肿瘤细胞K562有抑制和损伤作用，这为以后研发蝇防御素抗菌肽药物提供了依据。

ASIP基因及其重组蛋白对山羊脂肪细胞脂肪沉积的效应

为探索ASIP基因对山羊脂肪沉积的效应,本研究采集波杂山羊(BZ)和酉州乌羊(YZ)组织,并使用体外培养的山羊前脂肪细胞,采用基因克隆、实时荧光定量(qRT-PCR)、油红O染色等方法,检测ASIP基因在山羊组织和体外培养分化脂肪细胞中的表达规律,以及脂质生成关键基因在山羊脂肪和肌肉组织中的表达情况,分析重组ASIP蛋白对山羊脂肪细胞分化过程中脂滴形成及脂质生成关键基因表达的影响。结果表明,ASIP基因在山羊体组织中广泛表达,在肾脏和白色脂肪中的表达量最高;ASIP基因在山羊脂肪细胞分化6 d时显著升高(P<0.05),8 d时达到最高值。PPARG、LEPTIN和ATRN基因在YZ肾脂中的表达量显著高于BZ(P<0.05);PPARG、FASN和ATRN基因在BZ骨骼肌中的表达量显著高于YZ(P<0.05),FABP4和SREBP1基因的表达在两品种羊之间无显著差异。重组ASIP蛋白处理诱导山羊脂肪细胞在8 d出现明显脂肪滴,显著提高了细胞内甘油三酯含量(TG)(P<0.05),并显著或极显著上调脂肪细胞中脂质合成关键基因(PPARG、LEPTIN、FASN、FABP4、SREBP1和ATRN)的表达量。综上,ASIP基因及重组ASIP蛋白对山羊脂肪细胞的脂肪沉积可能具有正向调控作用。本研究结果为进一步解析ASIP基因调控山羊脂肪沉积机制提供了重要理论基础。

藏西北绒山羊子宫内膜容受性相关基因和可变剪接事件的综合分析

背景:藏西北绒山羊子宫内膜容受性是胚胎植入的关键因素,目前对于藏西北绒山羊子宫内膜容受性相关基因表达及可变剪接的认识还未明确。目的:分析并挖掘藏西北绒山羊子宫内膜容受性相关的基因和可变剪接事件。方法:在妊娠第5天和第15天(分别代表容受前子宫内膜组和容受性子宫内膜组),分别随机选取3只藏西北绒山羊,采集子宫内膜组织,苏木精-伊红染色观察组织形态,免疫组织化学检测子宫内膜容受性标志蛋白白血病抑制因子、血管内皮生长因子的表达水平;提取子宫内膜组织总RNA,质量检测合格后进行转录组测序,寻找差异表达的mRNA、长链非编码RNA、环状RNA和miRNA,进行功能预测,并分析与子宫内膜容受性相关的可变剪接mRNA和长链非编码RNA。结果与结论:(1)与容受前子宫内膜组比较,容受性子宫内膜组子宫内膜组织中白血病抑制因子和血管内皮生长因子蛋白的表达水平明显升高;(2)测序结果显示,差异表达基因多为mRNA和长链非编码RNA,包括250个上调的mRNA、193个上调的长链非编码RNA、135个下调的mRNA和123个下调的长链非编码RNA,显著富集于Wnt、Hedgehog和Hippo信号通路;(3)可变剪接事件分析显示有8个差异表达的可变剪接转录本,均为mRNA分子,其中2个下调、6个上调,与血管内皮生长因子受体信号、细胞运动和胚胎发育有关。

杉木ClOFP1基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

OFP基因家族在植物的生长发育中发挥重要调控作用。为探究ClOFP1在木质部形成过程中的作用,本研究通过克隆杉木ClOFP1基因,分析其表达模式,并开展该基因在杉木群体的单核苷酸多态性(SNP)及连锁不平衡(LD)分析。结果表明,ClOFP1基因的cDNA序列长1 648 bp,开放阅读框(ORF)长1 320 bp,在氨基酸序列的376~428位有卵形蛋白家族特有的OVATE结构域。系统进化树分析结果显示,ClOFP1蛋白与水稻、拟南芥中调控细胞伸长和次生壁形成的OsOFP19、AtOFP1、AtOFP4聚为一类。ClOFP1在幼嫩叶片和茎段中优势表达,随着叶片成熟和茎段木质化程度加深其表达量递减,幼叶中的表达量是老叶中的14倍。同时,在杉木木材中,ClOFP1主要在靠近树皮的边材区域表达,而在心边过渡区表达较弱。推测ClOFP1基因作为负调控因子,参与次生木质部的形成。共检测到ClOFP1基因内存在16个常见SNP位点,平均发生频率为1/103 bp。其中编码区域有11个SNP位点,分为7个同义突变和4个错义突变。7个地理种源的SNP多样性指数差异不显著,非同义突变多样性π_(ns)小于同义突变π_(s)。连锁不平衡分析结果发现,ClOFP1基因间的LD在875 bp左右长度内迅速消失,且SNPs具有3个较强的连锁不平衡区块。综上,ClOFP1的表达与杉木茎段木质化程度负相关,ClOFP1在不同无性系中SNP变异较为丰富,位点间的LD在较短序列长度内迅速消失,表明基于该基因的LD作图是可行的。本研究结果为深入解析ClOFP1功能和开展LD作图提供了重要依据。

CYP17A1基因突变致先天性肾上腺皮质增生症一例报道并文献复习

17α-羟化酶缺乏症(17-OHD)是先天性肾上腺皮质增生症(CAH)中的一种罕见类型,约占CAH的1%,其患病率为1∶50000。本文报道了1例疑似17-OHD患者,通过外显子测序鉴定了1个类固醇生成酶基因CYP17A1的基因突变,结合临床表现、体格检查、肾上腺和性腺功能检查等,最终将其明确诊断为CAH并给予规范治疗。故结合该病例,本文回顾总结了17-OHD的鉴别和诊断,以期提高临床对该病的认识,促进临床对17-OHD的规范诊治,为17-OHD的诊断和治疗提供更多的参考资料。

电针对运动大鼠腓肠肌组织代谢酶及自噬基因表达的影响

背景:急性运动易引起机体内骨骼肌组织损伤和体内脂代谢紊乱,但急性运动联合电针调控机体内代谢和自噬通路的机制尚不明确。目的:观察电针“足三里”和“环跳”穴对急性运动大鼠骨骼肌代谢酶及自噬水平的变化。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为安静对照组(10只)、模型组(20只)、逆电针组(20只),后两组设2个时相点,即运动后即刻和运动后3 h组,每个时相点10只大鼠。后两组进行适应性跑台运动训练后,进行急性运动训练,逆电针组大鼠于每天跑台训练前先介入电针治疗(参数为电针大鼠两侧“足三里”和“环跳”穴,连续波、频率2 Hz、强度2 mA、留针30 min、1次/d、连续7 d),电针后休息10 min再进行急性运动。分别于运动后即刻和运动后3 h麻醉取大鼠双侧腓肠肌组织,苏木精-伊红染色观察大鼠骨骼肌组织病理学变化;ELISA法检测大鼠骨骼肌组织肝脂酶、脂肪酸合成酶、激素敏感脂肪酶、肉碱棕榈酰转移酶1活性;免疫组织化学和Western Blot法检测自噬基因表达变化。结果与结论:①苏木精-伊红染色后模型组大鼠运动后即刻和运动后3 h腓肠肌纤维排列出现紊乱、肿胀、破裂;逆电针组大鼠运动后即刻和运动后3 h腓肠肌纤维排列紧密,肿胀和破裂的细胞大为减少,与安静对照组比较无明显性差异;②模型组和逆电针组运动后3 h的肝脂酶和脂肪酸合成酶活性均低于安静对照组(P<0.05或P<0.01);模型组和逆电针组大鼠运动后3 h的脂蛋白酯酶、激素敏感脂肪酶和肉碱棕榈酰转移酶1活性高于安静对照组(P<0.05或P<0.01),激素敏感脂肪酶和肉碱棕榈酰转移酶1活性在逆电针组运动后即刻高于模型组同期(P<0.05);与模型组运动后3 h相比,逆电针组运动后3 h脂蛋白酯酶活性升高(P<0.05),激素敏感脂肪酶活性降低(P<0.01);③免疫组织化学结果显示,P62、自噬相关基因5和自噬相关基因7表达在模型组大鼠运动后即刻和运动后3 h及逆电针组运动后即刻均高于安静对照组(P<0.05或P<0.01),其中运动后即刻和运动后3 h逆电针组大鼠P62及自噬相关基因7表达均低于模型组(P<0.05);④Western Blot结果显示,运动后即刻逆电针组大鼠P62和自噬相关基因7蛋白表达均低于模型组(P<0.05);Parkin蛋白表达在模型组大鼠运动后即刻和运动后3 h均高于安静对照组(P<0.05),逆电针组大鼠运动后即刻和运动后3 h均低于模型组(P<0.05);⑤提示急性运动引起大鼠腓肠肌纤维排列出现紊乱、肿胀、破裂,电针两侧“足三里”和“环跳”穴可改善大鼠骨骼肌脂代谢水平及调控自噬细胞,防止急性运动引起大鼠机体内脂代谢紊乱和腓肠肌组织的损伤,其机制可能与调控自噬相关因子P62、自噬相关基因5、自噬相关基因7、Parkin蛋白表达来促进大鼠骨骼肌细胞自噬的发生或调节细胞自噬通路密切相关。

加权共表达网络分析与机器学习识别类风湿关节炎滑膜中的关键基因

背景:类风湿关节炎是一种全身的免疫相关性疾病,主要病理特点是关节滑膜炎性增生及关节软骨的破坏,其发病机制目前尚不明确,迫切需要发现新的具有高度敏感性和特异性的诊断标志物。目的:联合使用生物信息学技术及计算机学习算法,识别并筛选类风湿关节炎患者滑膜中的关键基因,构建类风湿关节炎预测模型并进行验证。方法:从基因表达综合数据库中下载3个包含类风湿关节炎患者滑膜的数据集(GSE77298、GSE55235、GSE55457),GSE77298和GSE55235作为训练集,GSE55457作为测试集,共纳入66个样本,其中类风湿关节炎患者滑膜样本39个,正常滑膜样本27个。应用R语言筛选训练集中的差异基因,然后使用加权共表达网络将训练集中的基因模块化,选出关键模块中的特征基因,将差异表达基因和特征基因取交集,交集基因进入下一步机器学习。采用3种机器学习方法:最小绝对值收敛和选择算子算法、支持向量机-递归特征消除和随机森林算法对交集基因进一步分析获得枢纽基因,将枢纽基因再次相交即得到类风湿关节炎滑膜中的关键基因。以关键基因为变量构建预测类风湿关节炎的列线图模型,推测患者发生类风湿关节炎的危险程度,使用受试者工作特征曲线确定类风湿关节炎预测模型及其关键基因的诊断价值。结果与结论:①通过差异分析,训练集中共筛选出差异基因730个,加权共表达网络分析得到特征基因185个,两者交集基因159个;②最小绝对值收敛和选择算子发现枢纽基因4个,支持向量机-递归特征消除发现枢纽基因11个,随机森林发现枢纽基因5个,取交集后获得关键基因2个(TNS3、SDC1);③基于2个关键基因,在训练集及测试集种构建列线图,其校准预测曲线与标准曲线贴合较好,且预测类风湿关节炎发生的临床效能良好;④上述结果证实,基于生物信息及机器学习算法获得的TNS3和SDC1有可能成为类风湿关节炎诊断和治疗的关键靶点。

基于生物信息学对骨关节炎铁超载关键基因的筛选与验证

背景:铁超载是指体内铁积累过多的情况,可引起各种组织的病理改变。目前,对于骨关节炎中铁超载相关的分子机制和潜在基因靶点,仍有待进一步的研究和探索。目的:通过生物信息学手段分析骨关节炎铁超载关键基因,并利用动物实验加以验证,以期为铁超载角度防治骨关节炎提供新的思路。方法:使用GEO数据库和GeneCards数据库筛选出与骨关节炎相关的基因和铁超载相关的基因。然后,取两者的交集,得到骨关节炎和铁超载共同相关的基因集合。采用GO和KEGG富集分析筛选这些基因的功能和通路。为了进一步研究这些基因之间的相互作用,构建PPI网络,并利用Cytoscape软件的5种计算方法来识别骨关节炎铁超载的关键基因(Hub基因)。将12只雄性SD大鼠分为骨关节炎组与对照组(正常大鼠),每组6只,骨关节炎组大鼠采用改良Hulth方法建立膝骨关节炎模型,并使用PCR检测Hub基因在两组大鼠膝关节组织中的表达情况。结果与结论:①共获得51个骨关节炎铁超载基因,GO富集分析表明其主要参与细胞因子受体结合、趋化因子受体结合、细胞因子活性、生长因子受体结合及寡糖结合等过程;②KEGG富集分析表明骨关节炎铁超载基因主要参与肿瘤坏死因子信号通路、脂质和动脉粥样硬化等信号通路;③构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,进一步分析获得细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、肿瘤坏死因子配体超家族成员11(tumor necrosis factor superfamily member 11,TNFSF11)、骨髓瘤细胞癌基因(myelocytomatosis oncogene,MYC)、Janus激酶2(janus kinase 2,JAK2)及白细胞介素6,5个骨关节炎铁超载Hub基因,动物实验证实其在对照组与骨关节炎组大鼠膝关节组织中的表达有显著差异(P<0.05);④结果显示,ICAM-1,TNFSF11,MYC,JAK2及白细胞介素6可作为骨关节炎铁超载的关键基因,有望成为防治骨关节炎的新靶点。

骨关节炎中枢纽基因及在免疫浸润中作用的生物信息学分析与鉴定

背景:低度慢性炎症被认为在骨关节炎的发病机制中起着核心作用,但是具体的分子机制目前仍不清楚。目的:筛选和探讨骨关节炎中的潜在枢纽基因及免疫细胞的浸润情况。方法:将来自GPL570平台的GSE206848数据集与来自GPL96平台的GSE55235和GSE55457数据集合形成原始数据集。使用加权基因共表达网络分析去除离群样本,随后鉴定差异表达基因,并对差异表达基因进行功能富集分析。此外,构建差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络,并使用Cytoscape软件中的两种不同算法筛选枢纽基因。利用CIBERSORT算法评估骨关节炎样本与正常对照之间免疫细胞浸润比例的差异。通过对收集到的骨关节炎患者滑膜组织样本进行定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)实验,并结合来自GPL96测序平台的GSE12021数据集作为独立数据集,验证枢纽基因对骨关节炎的诊断能效。结果与结论:①在去除5个离群样本后,共鉴定出340个差异表达基因,其中包括159个上调基因和181个下调基因。通过加权基因共表达网络分析和Cytoscape共获得了6个枢纽基因。②CIBERSORT分析显示,骨关节炎组织中多种类型免疫细胞浸润比例与正常组织相比存在差异,6个枢纽基因的表达水平与骨关节炎中多种免疫细胞的相对比例密切相关。③RT-qPCR结果表明,6个基因的相对表达水平相对于正常组织呈下调趋势,但是NFKBIA和PTGS2的表达差异不显著(P>0.05);原始和外部数据集中的ROC曲线表明,6个枢纽基因对骨关节炎具有较强的诊断能力(AUC>0.8)。④结论:最终确定了4个枢纽基因,分别为CDKN1A、MYC、CXC趋化因子配体2和血管内皮生长因子A,可能通过介导免疫应答和炎症反应成为未来治疗骨关节炎的分子靶点。

纳米粒子在骨组织工程化基因修饰治疗中的应用

背景:传统的骨组织工程技术治疗临界骨缺损存在成骨效率低、安全性差等问题。而以非病毒纳米粒子为基因载体构建的基因强化型骨组织工程移植物,具有更高的成骨效率和安全性,引起了国内外学者的广泛关注和研究。目的:对当前国内外有关纳米粒子在组织工程成骨基因治疗研究中取得的新技术、新方法以及面临的挑战等进行综述,旨在为纳米粒子介导的骨组织工程基因治疗研究提供参考。方法:第一作者在Pub Med、Web of Science和中国知网数据库上进行文献检索,并以“Bone defect repair,Bone tissue engineering,Gene delivery,Nanoparticles,Non-viral gene vector,Sustained release technology,Sequential release,Targeted delivery”作为英文检索词,以“骨缺损修复,骨组织工程,基因递送,纳米粒子,非病毒基因载体,缓释技术,序贯释放,靶向递送”作为中文检索词,最终纳入84篇文献进行总结。结果与结论:(1)在骨缺损愈合的各个生理阶段进行针对性的基因递送可以显著增强骨修复效果。在早期炎症阶段,通过纳米粒子递送抗炎基因来调节炎症反应,可以为后续骨愈合奠定基础;在血管新生期,向局部递送促血管化基因有助于形成高度组织化、可灌注的血管系统,加快骨愈合速度;随着血管化的进行,骨骼的神经再支配也开始发生,此时递送促神经再生的功能性基因有利于促进神经化骨再生;在成骨阶段,通过构建纳米粒子-成骨基因复合物,可以直接提升支架及体内新骨形成的效率。(2)各种有机、无机纳米颗粒、金属有机框架和外泌体等非病毒纳米载体,在骨组织工程基因治疗中具有巨大的潜力,这些纳米基因载体各有其独特的优势和不足,因此在实际应用时,需要根据基因转染效率、生物安全性和成骨特性等因素选择最合适的类型。(3)为了全面提升递送基因的效果,目前主要通过对纳米载体进行各种功能设计来增强基因转染效率,包括增强缓释性和多基因递送序贯性等时间调控能力、增强对骨组织和成骨相关细胞的空间靶向能力、增强跨膜运输效率和细胞核靶向能力等全过程调控手段。(4)未来要进一步推动纳米粒子介导的骨组织工程基因治疗在临床上的应用,还需要克服诸多技术挑战,包括提高有机纳米基因载体的基因转染效率、降低无机纳米载体的生物安全性风险、优化新型纳米载体的生产工艺以及促进其它生理过程与成骨交互作用等,这些问题也是未来骨组织工程基因治疗的研究热点和潮流。

骨关节炎的氧化应激相关基因和免疫浸润分析

背景:目前对于骨关节炎的发病机制尚不清楚,缺乏有效控制疾病的手段,且研究多集中在免疫领域,对氧化应激领域研究较少。目的:探索氧化应激与免疫浸润在骨关节炎中的作用,并预测相关miRNA和治疗药物。方法:从GEO数据库中获取GSE55235数据集(10例骨关节炎样本和10例健康对照样本)和GSE55457数据集(10例骨关节炎样本和10例健康对照样本)进行合并,获取差异表达基因,并结合氧化应激基因得到差异表达氧化应激基因。对差异表达氧化应激基因进行KEGG、GO富集分析,并使用GSEA富集分析评价骨关节炎通路和生物过程。使用STRING在线平台和Cytoscape软件建立了蛋白质相互作用网络,运行Degree算法得到关键基因,从GEO数据库中获取GSE1919作为验证数据集,对关键基因进行差异分析及受试者工作特征曲线分析,得到核心基因。此外,用CIBERSORT对免疫浸润进行评估,并探索核心基因与免疫细胞的相关性,使用TargetScan对核心基因进行miRNA预测及使用DSigDB数据库对靶点药物进行预测。结果与结论:①确定了65个差异表达氧化应激基因和5个核心基因(IL1B、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN);②富集分析结果显示,差异表达氧化应激基因的主要聚焦点包括氧化应激、白细胞介素17、破骨细胞分化、流体剪切应力以及动脉粥样硬化等通路;③5个核心基因的受试者工作特征曲线下面积均>0.85,说明对诊断骨关节具有良好的特异性和敏感性,且与免疫细胞密切关联;④miRNA的预测结果是hsa-miR-3937,治疗小分子药物包括二甲双胍、离子霉素和塞来昔布等。结果表明:骨关节炎中存在氧化应激与免疫浸润,且免疫浸润参与激活氧化应激。核心基因及预测的miRNA可作为诊断骨关节炎的新型标志物,预测的小分子药物可治疗骨关节炎。

三疣梭子蟹附肢再生过程中qRT-PCR内参基因的筛选与Wnt7b表达研究应用

为筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生过程中的最适内参基因,以附肢再生不同阶段的三疣梭子蟹为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对细胞骨架蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、18S rRNA(18S)、转录延伸因子基因(EF1α)、核糖体蛋白L18基因(RPL18)、细胞色素C氧化酶基因(COX)和组蛋白基因(HIS)共7个候选内参基因在肌肉、眼柄、血淋巴、肝胰腺、鳃、心脏和再生附肢共7种组织中的表达水平进行检测,并利用△Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对候选内参基因的稳定性进行评价,筛选出合适的内参,最后以最适内参基因作为参考,分析再生相关基因Wnt7b的表达水平。结果显示,在不同组织中综合稳定性最好的是RPL18,而在不同再生阶段的再生附肢中β-actin和RPL18基因做双内参基因更适合。以RPL18和β-actin作双内参基因研究Wnt7b的表达水平时发现,Wnt7b基因在三疣梭子蟹附肢再生过程中的表达呈先上升后下降再上升的趋势;Wnt7b基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,除再生附肢和血淋巴外其他组织中的表达量都较低。本研究结果为甲壳类再生发育相关研究内参基因的选择及分子调控机制研究提供了参考。

人参Defensin基因表达载体构建及对锈病抗性分析

通过人参Defensin基因在拟南芥中的过表达,研究其在人参锈病菌胁迫过程中的抗性作用。采用RT-PCR技术克隆人参Defensin基因,其全长为240 bp,编码80个氨基酸,预测其蛋白分子量为12.091 1 ku。通过农杆菌介导浸花法将人参Defensin基因转到拟南芥中,经过抗性筛选及分子鉴定获得转基因拟南芥。以野生型拟南芥作对照,分析植株对锈病菌的抗性作用。结果表明:经锈病菌胁迫5 d,转基因拟南芥的生长状态明显优于野生型拟南芥,Defensin基因在转基因拟南芥中的表达量极显著高于野生型对照。人参Defensin基因对人参锈病菌具有一定的抗性作用。

骨关节炎核心基因的生物信息学鉴定

背景:目前骨关节炎成为影响老年人生活质量的主要疾病,治疗效果欠佳,临床治疗措施主要集中在阻止疾病的进程,同时骨关节炎的发病机制尚不完全清楚。为了探索骨关节炎的主要发病机制和基因编码调控的相关机制,进行生物信息学分析。目的:通过基因表达谱筛选出在骨关节炎中起主要作用的核心差异基因。方法:从基因表达综合数据库(GEO)下载数据集:GSE114007、GSE117999和GSE129147,利用R软件筛选出GSE114007和GSE117999数据合集的差异基因,将差异基因进行加权基因共表达网络分析,选择和骨关节炎最相关的模块基因并进行蛋白互作分析,利用cytocape软件筛选出候选核心基因,随后将候选核心基因进行最小绝对收缩和选择算子回归(LASSO回归)和COX分析,鉴定出在骨关节炎中起关键作用的核心基因,利用外部数据集GSE129147验证核心基因的准确性。结果与结论:①共鉴定出477个差异基因,加权基因共表达网络分析获得265个和骨关节炎相关的差异基因,共鉴定8个候选核心基因,LASSO回归分析最终获得了一个具有核心价值的差异基因ASPM并进行了外部验证;②提示通过生物信息学筛选出基因ASPM表达异常在骨关节炎中起到关键核心作用。

阿戈美拉汀缓解APP/PS1转基因小鼠焦虑及抑郁样行为的机制

背景:阿戈美拉汀在临床上用于治疗焦虑、抑郁等相关精神行为异常。前期研究证实,阿戈美拉汀能够有效缓解阿尔茨海默病模型小鼠的认知行为、海马突触可塑性及脑病理特征,然而阿戈美拉汀能否改善阿尔茨海默病模型小鼠的焦虑和抑郁样行为仍不清楚。目的:探究阿戈美拉汀对APP/PS1(阿尔茨海默病)转基因小鼠焦虑和抑郁样行为的改善效应及分子机制。方法:①将18只APP/PS1转基因小鼠随机分为模型对照组(n=9)、模型干预组(n=9),将18只野生型小鼠随机分为对照组(n=9)、干预组(n=9),模型干预组与干预组小鼠腹腔注射阿戈美拉汀10 mg/(kg·d),连续注射31 d后进行高架十字迷宫、强迫游泳行为学实验与海马组织mRNA测序。②取小鼠海马神经元细胞株(HT22)、脑微血管内皮细胞株(bEnd.3),分别分4组培养:空白组不加入任何药物,药物组加入20µmol/L阿戈美拉汀,模型组加入10µmol/Lβ-淀粉样蛋白1-42,实验组加入10µmol/Lβ-淀粉样蛋白1-42+20µmol/L阿戈美拉汀,培养24 h后,免疫印迹检测HT22细胞S416p-tau和S9p-GSK3β的蛋白表达,免疫印迹检测bEnd.3细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白1、糖基化终产物受体的蛋白表达。结果与结论:①在高架十字迷宫实验中,模型对照组小鼠的探索开放臂时间与开放臂进入次数均少于对照组(P<0.05),模型干预组小鼠的探索开放臂时间与开放臂进入次数均多于模型对照组(P<0.05);在强迫游泳测试中,模型对照组小鼠的不动时间长于对照组(P<0.05),模型干预组小鼠的不动时间短于模型对照组(P<0.05);海马组织mRNA测序显示,阿戈美拉汀可以增强APP/PS1小鼠海马区低密度脂蛋白受体相关蛋白1的表达。②免疫印迹检测显示,模型组HT22细胞S416p-tau蛋白表达高于空白组(P<0.05),实验组HT22细胞S416p-tau蛋白表达低于模型组(P<0.05),药物组HT22细胞S9p-GSK3β蛋白表达高于空白组(P<0.05),实验组HT22细胞S9p-GSK3β蛋白表达高于模型组(P<0.05),实验组bEnd.3细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白1蛋白表达高于模型组(P<0.05)。③结果表明,阿戈美拉汀可通过促进脑内β-淀粉样蛋白和tau的清除来缓解阿尔茨海默病小鼠的焦虑和抑郁样行为。

普通烟草PYL基因家族成员鉴定及干旱胁迫下基因表达分析

PYR/PYL/RCAR(PYL)蛋白作为脱落酸(ABA)的直接受体,在ABA信号转导途径中发挥着关键调控作用。为探究PYL基因在烟草中的系统发育和表达模式,本研究利用生物信息学手段在普通烟草品种K326全基因组范围内进行了鉴定分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了各基因在遭受干旱胁迫0、1、3、6、12、24、36和48 h的基因表达量。结果共鉴定到26个烟草PYL基因,依据系统发育和结构特点可划分为3个亚家族(Ⅰ~Ⅲ),成员数目分别为9、11和6。蛋白理化性质分析结果表明,所有烟草PYL蛋白都呈亲水性,氨基酸长度在173~586 aa之间,相对分子量在16 763.26~65 709.39 Da之间,等电点(pI)在4.73~9.05之间。顺式作用元件分析结果发现,烟草PYL基因启动子区含有MYB、NAC、WARKY、TCP、ZF-HD等逆境胁迫响应相关元件。基因表达结果显示,烟草PYL基因在遭受干旱胁迫后,除NtPYL8、NtPYL9、NtPYL17和NtPYL21基因外、其余基因表达量整体表现为上调趋势,但各亚家族成员间基因表达具有明显差异。其中亚家族Ⅱ中NtPYL1、NtPYL2、NtPYL4基因和亚家族Ⅲ中NtPYL25基因在遭受干旱胁迫6~12 h后基因表达量达到最高,且相对表达量较0 h上升显著,可作为烟草应答干旱胁迫的重要候选基因。本研究为进一步开展烟草候选抗旱PYL基因功能研究及育种利用奠定了基础。