青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。

兰州百合基因枪转化方法的研究

以兰州百合试管苗鳞片叶为受体,通过基因枪转化法将脱氢抗坏血酸还原酶基因(DHAR)转入兰州百合,并用GUS染色、PCR扩增和Southern杂交等技术进行转基因株系的检测.结果表明:以兰州百合鳞片叶为受体材料,在轰击压力1 100 psi、轰击距离6 cm时,抗性率高达14%,转化率为1.5%;10 mg/L的潮霉素对鳞片叶具有很好筛选作用.GUS分析发现,转化株系叶片为蓝色;PCR检测和Southern杂交进一步证实抗性株系为转基因植株,且为单拷贝.

高效液相色谱法同时测定水果蔬菜中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、脱氢抗坏血酸及总维生素C的含量

建立了同时测定水果或蔬菜中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、脱氢抗坏血酸及总维生素C含量的高效液相色谱分析方法。用偏磷酸提取水果或蔬菜样品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸和脱氢抗坏血酸,提取液中的L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸可直接进行检测,脱氢抗坏血酸在磷酸钠溶液中（pH 7.0-7.2）用L-半胱氨酸还原成L-抗坏血酸,之后测定以L-抗坏血酸表达总维生素C含量,脱氢抗坏血酸含量由总维生素C含量减去L-抗坏血酸含量获得。采用C18色谱柱分离,以甲醇-磷酸盐缓冲溶液（pH 3.5）为流动相,在245 nm下检测,外标法定量。结果表明,在0.5-50 mg/L的浓度范围内L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的线性关系良好,相关系数大于0.999,检出限分别为42.0,19.4μg/kg,脱氢抗坏血酸的检出限为262μg/kg。低、中、高3个浓度的加标水平下,3种物质的加标回收率为82.8%-111.3%,相对标准偏差（RSD）小于15%。该方法操作简单,灵敏度高,准确性好,适用于水果和蔬菜中维生素C的测定。

山楂加工中还原型V_C和氧化型V_C含量变化的研究

目的研究山楂加工过程中还原型VC和氧化型VC含量的变化。方法通过观测山楂打浆、糖煮和干燥工序中还原型VC和氧化型VC含量的变化,来研究其变化规律。结果应用EDTA二钠和茶多酚处理能控制打浆中还原型VC损失,添加六偏磷酸钠可控制氧化型VC损失。真空糖煮比常压糖煮有利于山楂还原型VC含量的保持,但对氧化型VC含量影响不大。干燥对山楂还原型VC与氧化型VC含量均有显著影响。真空干燥和微波干燥有利于山楂还原型VC含量的保持。结论山楂果实含有较多的氧化型VC,其在加工过程中变化较明显,对山楂制品的总VC含量有显著影响。

条锈菌侵染慢锈性小麦品种川麦107后的蛋白质组学分析

为了在基因和蛋白表达水平上研究小麦的慢条锈性机制,运用双向电泳技术分析了条锈菌侵染的2个小麦品种(川麦107和80-8)的对照和发病14 d叶片的差异表达蛋白,从2-D图谱上找到9个差异表达蛋白,其中点P5是在接种并发病的川麦107中新诱导出的一个差异蛋白质。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)获得6个蛋白质的肽指纹图谱(PMF),数据库搜索鉴定出2个蛋白质。这2个蛋白质是磷酸核酮糖激酶(Phosphoribulokinase,PRK)和脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbate re-ductase,DHAR)。

猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。

氮素形态对菠菜体内抗坏血酸含量及其代谢的影响

采用基质培养试验,研究营养液不同铵硝配比(0:100,25:75,50:50,75:25,100:0)对菠菜叶片抗坏血酸含量及其代谢相关酶活性的影响.结果表明,菠菜植株鲜重和干重以铵硝比为25:75处理最高,铵硝比超过50:50时则显著下降.菠菜叶片抗坏血酸(AsA)、总抗坏血酸(AsA+DHA)含量随着铵硝比的提高逐渐增加.菠菜叶片L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)活性在铵硝比小于50%时没有显著变化,进一步提高铵硝比则显著降低;铵硝比不影响抗坏血酸氧化酶(AAO)的活性.脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)的活性均随着供铵比例提高而逐渐提高,且与AsA含量的变化趋势相似.表明提高营养液中铵硝比增加菠菜叶片AsA含量,与其提高MDHAR、DHAR活性和加快AsA的再生循环有关,而与其对GalLDH和AAO酶活性的影响没有明显的相关.

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致。该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸。通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性。结果表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径。

水果还原型VC和氧化型VC的含量及稳定性研究

分析测定了常见水果的还原型VC(Ascorbicacid,AA)与氧化型VC(Dehydroascorbicacid,DHA)的含量,并研究了空气和热处理对其AA与DHA含量的影响。结果表明,不同的水果种类,其AA与DHA含量有较大差异,除大枣以外,富含AA的水果,其DHA占总VC的比例大,AA含量低的水果,其DHA占总VC的比例小;水果破碎后与空气接触能够明显降低水果AA含量,增加其DHA含量;加热时间对水果AA含量有极显著的影响,但加热温度对不同水果有不同的影响,不同的水果种类,其DHA对加热温度和时间的反应不同。

抗坏血酸降解机理以及脱氢抗坏血酸对食品的影响研究进展

L-抗坏血酸(L-ascorbic Acid,AA)在食品中既能发挥抗氧化、抗褐变的作用,又能在食品体系中发生降解氧化产生褐色色素。因此正确认识其发生降解的机理,保护AA在食品中稳定性至关重要。该研究比较详细地综述了AA在不同条件下(氧、温度、pH值、底物浓度)的自降解机理以及参与美拉德反应的降解过程,同时对抗坏血酸降解产物-脱氢抗坏血酸(Dehydroascorbic Acid,DHAA)在食品中的有利和不利影响进行了总结,一方面DHAA可与面筋巯基交联,提高面团筋性;而另一方面,DHAA又会导致酚类物质降解,导致食品抗氧化能力降低;并且DHAA能够与蛋白质形成糖基化终产物,对人体产生有害物质。该综述以期为AA在食品加工中的降解提供更全面的研究视角。

去氢抗坏血酸分子振动光谱的理论研究

采用RHF,MP2,DFT(B3LYP)方法,以6-311++G**为基组研究了去氢抗坏血酸分子(DHA)的平衡几何构型和振动光谱.计算结果表明,采用RHF,B3LYP以及MP2方法优化得到的几何结构以及频率值是一致的.采用B3LYP/6-311++G**计算了DHA分子平衡构型下的谐振动力场、振动频率和振动强度.使用Wilson的GF矩阵方法对DHA分子进行了简正坐标分析,依据所得的势能分布对DHA分子的振动基频进行了合理的理论归属.

棉花脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆、原核表达与纯化

为进一步探讨脱氢抗坏血酸还原酶的生物学功能,克隆棉花的脱氢抗坏血酸还原酶基因,对该基因进行了原核表达,并对重组蛋白进行纯化和分析。通过RT-PCR方法扩增脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,利用BamH I和Xhol I酶切位点将其克隆至组氨酸(histidine,His)融合蛋白表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(isopropy--βD-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物,并用亲和层析柱纯化重组表达的pET28a-DHAR蛋白。结果表明:重组体PET28a-DHAR经测序和酶切鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析目的蛋白高效表达,相对分子量为26 kD左右,并获得了纯化的His-DHAR融合蛋白。

尿毒症患者血浆及透析液中维生素C的测定(英文)

应用高效液相色谱结合电化学检测技术建立了尿毒症病人血浆及透析液中抗坏血酸 (AA)及脱氢抗坏血酸(DHAA)的测定方法。采用 0 8g/L偏磷酸与 18% (体积分数 )高氯酸的混合溶液作为生物样本中的蛋白沉淀剂及AA的提取剂 ,可大大提高AA在血浆中的稳定性。该方法已成功地应用于临床维生素C的常规检验。AA浓度为2 μmol/L～ 40μmol/L时 ,其峰面积与浓度的相关系数大于 0 99。AA与DHAA的日内相对标准偏差 (RSD)分别小于 8 9%和 10 5 %。AA在血浆及透析液中的回收率分别大于 95 %和 78%。

棉花GhDHAR3基因克隆、功能序列分析及烟草的遗传转化

对棉花EST数据库进行同源搜索、比对和序列拼接,经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR3的cDNA,其开放阅读框为792bp,编码由263个氨基酸组成的蛋白质。同源性比对分析显示GhDHAR3蛋白具有较高的保守性,进化树分析表明其与拟南芥AtDHAR3亲缘关系较近。利用软件进行蛋白质序列分析,GhDHAR3蛋白具有GST-N家族和GST-C-DHAR典型的结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族。将GhDHAR3基因构建到植物真核表达载体pCAMBIA2300中,利用农杆菌通过叶盘法转化烟草,经PCR分子鉴定,获得了含GhDHAR3转基因烟草植株。首次克隆棉花DHAR基因,通过结构域分析其可能的作用并成功转化烟草。

植酸对控制打浆中水果Vc损失的效应

研究了植酸对控制草莓、猕猴桃和山楂果实打浆工序中Vc损失的效应。结果表明,植酸对三种水果打浆工序中还原型Vc(AA)和氧化型Vc(DHA)的保护效果不一,植酸可以明显提高山楂打浆中的AA和DHA保存率;对猕猴桃仅提高其DHA保存率,不能提高AA保存率。对草莓AA和DHA的保存效果则与猕猴桃相反。

棉花GhDHAR2基因克隆、功能序列分析及原核表达

通过RT-PCR方法从棉花纤维组织中克隆得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR2的cDNA,该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸的蛋白质。同源性序列对比分析显示,GhDHAR2蛋白具有较高的保守性,具有典型的功能结构域,包括GST-N家族和GST-C-DHAR家族的功能结构域;进化树分析显示GhDHAR2和拟南芥AtDHAR2在进化关系上较近。将GhDHAR2基因连接到原核表达载体pET-28a中,将重组载体pET28a-GhDHAR2转入到表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达出重组GhDHAR2蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示重组蛋白大小约为28 kD,诱导表达的重组蛋白具有较高的DHAR活性。首次克隆了棉花GhDHAR2基因,通过结构域分析其可能的作用,并成功进行蛋白体外表达及酶活性分析。

5龄期和吐丝期家蚕丝腺中的抗坏血酸含量及抗氧化作用变化

抗坏血酸(AsA)是家蚕生长发育的必需维生素之一,具有抗氧化的生理功能。用分光光度法测定5龄期至吐丝期家蚕丝腺中的抗坏血酸含量、脱氢抗坏血酸(DHA)含量、抗坏血酸氧化酶(AAO)活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性,分析丝蛋白合成和分泌期间丝腺中抗坏血酸的抗氧化作用变化。结果显示在此期间丝腺中的AsA含量、总抗坏血酸(AsA和DHA)含量和AsA/DHA比值持续下降,DHA含量变化不显著,而没有检测到AAO和APX的活性,并且DHAR的活性在5龄期变化不显著,但在吐丝期持续下降。检测结果表明,伴随着丝蛋白的合成和分泌,家蚕丝腺中的抗坏血酸含量及抗氧化作用显著下降。

枣汁加工中还原型VC和氧化型VC保存率变化的研究

研究枣汁加工过程中还原型VC(ascorbic acid,AA)和氧化型VC(dehydroascorbic acid,DHA)变化及其控制,通过观测枣汁软化、浸提和杀菌工序中还原型VC和氧化型VC保存率的变化,来研究其变化规律。结果表明:微波软化能够保持较高的还原型VC和氧化型VC保存率。在浸提制汁过程中,采用抗氧化剂处理,对还原型VC和氧化型VC的保持效果以0.03%的六偏磷酸钠最好,0.07%的茶多酚次之;常压10min杀菌有利于AA和DHA保存。

抗坏血酸降解产物的色谱分析

目的 :用色谱法检查抗坏血酸中的降解产物。方法 :采用TLC和HPLC分别检出抗坏血酸中的降解产物。TLC采用硅胶G板 ,展开剂为乙醇 乙醚 水 冰醋酸 ( 65∶2 5∶10∶0 .1) ,显色剂为 10 %磷钼酸 ;HPLC选用硅胶柱 ,流动相为 0 .0 2mol·L-1KH2 PO4 乙腈 ( 1∶3 ) ,检测波长 2 10～ 3 0 0nm。结果 :经破坏后的抗坏血酸在TLC中 ,Rf值约 0 .8处检出去氢抗坏血酸斑点 ;HPLC中检出三个杂质峰 ,其最大吸收波长分别为 2 10、2 3 0、2 5 6nm。结论 :以上色谱条件可检出抗坏血酸的降解产物 。

箭舌豌豆根系抗坏血酸及相关酶对镉胁迫的响应

以箭舌豌豆(Vicia sativa L.)品种L3(耐镉)和ZM(镉敏感)为材料,研究了不同程度镉胁迫下箭舌豌豆幼苗根系抗坏血酸(AsA)含量、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)同工酶活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)同工酶活性以及APX基因表达的变化。结果显示:(1)2个箭舌豌豆品种根系AsA和脱氢抗坏血酸(DHA)含量在镉胁迫下显著升高;AsA/DHA比值在镉耐性品种L3中显著升高,在敏感品种ZM中显著下降;相同镉处理浓度下,L3根系AsA含量和AsA/DHA比值显著大于ZM。(2)2个品种根系DHAR的活性电泳共显示4条同工酶条带,它们的活性均随镉处理浓度的升高而升高;其中DHAR1只在L3显示,DHAR4只在ZM显示;相同镉处理浓度下,品种L3的DHAR的总活性大于品种ZM。(3)2个品种根系APX的活性电泳共显示11条同工酶条带,其中的APX1、2、4仅在敏感品种ZM中受镉胁迫诱导,APX 8在耐性品种L3中受到比敏感品种ZM更显著的诱导;克隆得到1个箭舌豌豆APX基因,荧光定量RT-PCR结果显示该基因的转录在L3和ZM根系均受镉处理诱导。研究表明,镉胁迫下2个箭舌豌豆品种根系AsA含量,AsA代谢相关酶DHAR和APX的活性以及APX的转录水平均显著升高;镉耐性品种L3较敏感品种ZM能更有效地促进AsA循环,维持更高的AsA水平,从而更有效地缓解镉胁迫诱导产生的氧化胁迫,这可能是L3较ZM具有更高镉耐性的重要机制之一。