弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析

本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7（GRA7）基因原核表达重组质粒，进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性。设计合成引物，从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析。目的片段用EcoRI和BamHI双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7，而后转人大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达，Westernblotting分析表达蛋白。结果显示，从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710bp的GRA7基因片段，构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序，目的基因片段与预期相符。重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后，可高效表达重组蛋白，Westernblotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别，而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白。原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性，为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础。

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7(densegranuleprotein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。方法从弓形虫不同分离株(RH株、ZS2株和GT株)的基因组中特异地扩增出GRA7基因,将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达,对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Westernblotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,ELISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同;pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,Westernblotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白,且能被人抗弓形虫阳性血清所识别;ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性;GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达,且该重组蛋白具有一定免疫反应性。

弓形虫致密颗粒蛋白的生物学功能及免疫原性研究的新进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)可引起严重的人兽共患弓形虫病,给全世界经济造成巨大的损失,给公共卫生安全带来巨大的隐患。致密颗粒(dense granule)分泌的致密颗粒蛋白(dense granule proteins,GRAs)参与调节纳虫泡(parasitophorous vacuole,PV)及纳虫泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)的形成并能维持其结构稳定性,部分GRAs可参与宿主细胞的转录。近几年来,不断发现了多种新的GRA蛋白家族新成员,并随着对该家族成员研究的逐步深入,发现GRAs是研制抗弓形虫疫苗的候选分子之一。本文综述了弓形虫致密颗粒蛋白的生物学功能和免疫原性研究的新进展,旨在为研究弓形虫致病机理和研发新的抗弓形虫疫苗提供思路。

大黄泄浊颗粒保留灌肠对非透析慢性肾脏病肾性骨病湿热证患者骨密度及血清骨形成蛋白-7的影响

目的观察非透析慢性肾脏病（chronic kidney diseases，CKD）肾性骨病湿热证患者腰椎骨密度（bone mineral density，BMD）和血清骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）水平及大黄泄浊颗粒保留灌肠的干预作用。方法将64例非透析CKD3～5期湿热证患者随机分为治疗组和对照组各32例（结果每组失访2例），并设正常组20例。两组均给予基础治疗，治疗组加用大黄泄浊颗粒保留灌肠，每日1次，疗程均为8周。治疗前后分别观察两组血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），血清肌酐（serum creatinine，SCr）、钙（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，iPTH）、BMP-7水平及第24腰椎BMD。结果治疗组临床疗效显著优于对照组（P〈0．05）。治疗4周末和8周末，两组中医证候积分均较前一时点显著降低（P〈0．05），且治疗组积分均显著低于对照组（P〈0．05）。治疗组在降低BUN、SCr和血清P、iPTH、ALP方面，以及在升高血清Ca和肾小球滤过率估算值方面均显著优于对照组（P〈0．05）。与正常组比较，CKD病例组BMD和BMP-7均显著降低（P〈0．05）；两组治疗后BMD和BMP-7均显著升高（P〈0．05），而治疗组BMD和BMP-7升高值均显著大于对照组（P〈0．05）。结论非透析CKD肾性骨病湿热证患者BMD和BMP-7水平均显著低于健康人群；大黄泄浊颗粒保留灌肠可防治非透析CKD肾性骨病，其机制可能与改善肾功能及升高血清BMP-7含量有关。

连黄降浊颗粒对自发性高血压大鼠肾组织TGF-β_1/smads信号传导通路的影响

目的:观察连黄降浊颗粒对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat,SHR)肾组织转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β_1/smads信号传导通路的影响。方法:雄性10周龄SHR40只,按体重随机分为4组:模型组、苯那普利对照组(对照组)、连黄降浊颗粒低剂量组(低剂量组)、连黄降浊颗粒高剂量组(高剂量组)各10只,采取切除所有大鼠右肾的方法制备高血压性肾损害模型。另取10只同周龄Wistar-Kyoto(WKY)大鼠同样切除右肾,作为正常血压对照组(WKY组)。造模1周后给予相应浓度和剂量的药物。给药第4周、8周末观察大鼠尿微量白蛋白(m Alb)、尿微量白蛋白与尿肌酐比值(m Alb/Ucr)和血清肌酐(Scr)。于第8周末处死所有动物,取其肾组织行HE染色、PAS染色和Masson染色,观察病理变化并半定量计算肾小管损伤指数(tubulointerstitial injury index,TII),免疫组化法检测骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein,BMP-7)、TGF-β_1、smad2、smad7在肾组织的表达。结果:造模1周以及给药第4周、第8周,4组SHRm Alb、m Alb/UCr、Scr随时间延长呈逐渐升高趋势,且差异均与WKY组差异有统计学意义(P<0.01),而给药前4组SHR之间上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。给药4周后,SHR中3个治疗组m Alb、m Alb/UCr、Scr显著低于模型组(P<0.05),高剂量组明显低于对照组(P<0.05)。8周时组间比较,低剂量组、高剂量组SHR上述指标明显低于对照组(P<0.05),高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。HE染色、PAS染色显示WKY组大鼠肾组织形态大致正常。HE染色显示,3个治疗组SHR肾组织损害较模型组明显减轻,高剂量组病理改善更明显。PAS染色进行TII评分发现,3个治疗组大鼠TII显著低于模型组(P<0.05),高剂量组明显低于模型组和低剂量组(P<0.05)。TGF-β_1和Smad2在WKY组呈无或弱阳性,而BMP-7和Smad7呈强阳性表达。与模型组相比,TGF-β_1、Smad2在3个治疗组大鼠肾组织的表达下调(P<0.05),2个中药治疗组大鼠肾组织的表达低于对照组(P<0.05);3个治疗组BMP-7、smad7在肾脏组织的表达上调(P<0.05),2个中药治疗组大鼠肾组织的表达高于对照组(P<0.05)。结论:连黄降浊颗粒可能通过干预BMP-7/TGF-β_1/Smads信号转导通路抑制了TGF-β_1在肾组织的表达,而对SHR肾间质纤维化起到了治疗作用。

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。

金纳米簇可视化免疫传感器检测弓形虫GRA7抗体的研究

目的建立基于重组弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)的金纳米簇可视化免疫传感器,用于检测弓形虫GRA7抗体,并评价其检测性能。方法利用重组表达质粒pQE-60-gra7的大肠埃希菌M15诱导表达并纯化GRA7,Western blot鉴定其反应原性。采用谷胱甘肽还原法制备金纳米簇,连接羊抗人IgG;以GRA7作为捕获抗原,构建检测血清GRA7抗体的金纳米簇可视化免疫传感器,评价其敏感度、特异性、阴性预测值、阳性预测值和诊断效率。结果表达纯化获得具有良好反应原性的GRA7,分子质量约为30 ku;建立的金纳米簇可视化免疫传感器检测血清GRA7抗体的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值以及诊断效率分别为76.1%、94.8%、94.4%、73.0%、78.2%。结论基于重组弓形虫GRA7建立的金纳米簇可视化免疫传感器检测弓形虫GRA7抗体敏感、特异,且诊断效率高,可用于弓形虫感染的抗体检测。

重组弓形虫GRA7的纳米金免疫传感器检测弓形虫GRA7抗体

目的:建立基于重组弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)的纳米金免疫传感器检测血清GRA7抗体,评价其检测性能。方法:体外合成gra7基因,构建重组表达质粒pQE-60-gra7,表达并纯化GRA7,Western blot鉴定其免疫活性;种子生长法制备金纳米棒,构建GRA7的纳米金免疫传感器检测人血清GRA7抗体,评价其灵敏度和特异度,并计算阳性、阴性预测值以及诊断效率。结果:成功构建重组表达质粒pQE-60-gra7,纯化GRA7显示良好的反应原性;GRA7的纳米金免疫传感器检测人血清弓形虫GRA7抗体的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为73.21%、100%、100%、77.94%、86.24%。结论:重组弓形虫GRA7的纳米金免疫传感器可用于弓形虫GRA7抗体的检测。

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。

尿毒清颗粒联合羟苯磺酸钙治疗慢性肾衰竭的疗效及对结缔组织生长因子、骨形态发生蛋白-7的影响

目的探讨尿毒清颗粒联合羟苯磺酸钙治疗慢性肾衰竭的疗效及对结缔组织生长因子(CTGF)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的影响。方法采用回顾性总结研究方法,2016年4月—2018年1月选择在安阳市第六人民医院进行维持性血液透析的慢性肾衰竭患者92例,根据治疗方法的不同分为观察组与对照组各46例,对照组给予羟苯磺酸钙治疗,观察组在对照组治疗的基础上给予尿毒清颗粒治疗,两组都治疗观察3个月,记录CTGF、BMP-7变化情况。结果观察组的总有效率为97.8%,高于对照组的87.0%,对比差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组血清血尿素氮(BUN)与肌酐(Scr)值都显著高于治疗前(P<0.05),治疗后观察组显著低于对照组(P<0.05)。治疗后两组血清CTGF值显著降低、BMP-7值显著升高,对比差异有统计学意义(P<0.05),治疗后观察组与对照组对比差异也有统计学意义(P<0.05)。治疗后观察组的人际关系敏感、抑郁、焦虑、精神病性、敌对性、恐怖、偏执、躯体化、强迫症状等评分低于对照组,对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论尿毒清颗粒联合羟苯磺酸钙治疗慢性肾衰竭能提高治疗效果,调节CTGF和BMP-7分泌平衡,改善患者的肾肾功能,提高患者的生活质量。