devR基因调控的结核分枝杆菌细胞毒性的研究

目的阐明devR基因表达对分枝杆菌生长及感染能力的影响。方法确认野生型牛分支杆菌卡介苗（M.bovis BCG,简称BCG）、devR基因敲除的BCG菌株（简称ΔdevR）和devR基因回补的BCG菌株（简称devR.com）的devR序列正确;在不同时间点测定600 nm下的吸光度（A）值,绘制3种细菌的生长曲线;以感染复数（MOI）=10感染人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549（简称A549细胞）和小鼠巨噬细胞Raw264.7（简称Raw264.7细胞）,分别采用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验于0、24、48、72 h测定细胞凋亡率和乳酸脱氢酶（LDH）释放水平;采用实时定量PCR（RT-PCR）测定凋亡相关基因bcl-2和bad的表达水平。结果ΔdevR菌株在早期（培养2-10 d）生长较BCG菌株和devR.com菌株明显加快（P〈0.01）。ΔdevR菌株感染A549细胞和Raw264.7细胞后,细胞的凋亡和坏死效应明显增加,与BCG菌株和devR.com菌株比较差异有统计学意义（P〈0.05）。3种菌株感染A549细胞均导致凋亡相关基因bcl-2表达上调,且ΔdevR菌株感染组bcl-2基因表达明显高于BCG和devR.com菌株感染组;3种菌株感染Raw264.7细胞均导致凋亡相关基因bad表达上调,且ΔdevR菌株感染组bad基因表达明显高于BCG和devR.com菌株感染组。结论 devR基因敲除的BCG菌株毒力明显增强。

结核分枝杆菌体外休眠模型的建立

目的:模拟结核分枝杆菌体内缺氧和微营养的生长环境建立其休眠模型。方法:将牛分枝杆菌卡介苗野生株BCG菌株在"微需氧+pH5.0+10%Dubos"的条件下培养,以菌株生长停滞,菌体表面脂质体增厚为休眠标准进行鉴定。取不同时间菌株测定600 nm下的吸光度(A)值绘制生长曲线,同时进行金胺O-尼罗红(Auramin-O,Nile Red)双荧光染色和实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime-PCR,qRT-PCR)检测休眠相关基因的表达量,确定菌株进入休眠状态。结果:在休眠条件培养过程中,BCG菌株的生长速度与常规条件培养菌株相比明显减慢(P<0.01),并且在休眠条件培养中第10、14和18天细菌生长基本接近停滞状态(P<0.01);同时金胺O荧光染色显示绿色荧光减弱,尼罗红红色荧光增强;休眠相关基因hspX、devR表达量逐渐上调,且培养第18天菌株明显高于第0天培养菌株(P<0.05)。结论:应用"微需氧+p H5.0+10%Dubos"条件培养,以金胺O-尼罗红染色和devR表达为标准,可以成功建立结核分枝杆菌休眠模型。