异甘草素对大鼠C6胶质瘤细胞增殖和分化的影响

目的研究异甘草素对大鼠C6胶质瘤细胞增殖和分化的影响。方法采用磺酰罗丹明B(SRB)比色法和克隆形成实验考察异甘草素对C6胶质瘤细胞增殖抑制作用;Giemsa染色观察细胞形态学变化;半定量RT-PCR、Western blot鉴定细胞分化相关基因及蛋白表达水平。结果大鼠C6胶质瘤细胞经异甘草素诱导后,以浓度依赖性抑制细胞增殖(P<0.01);光镜观察到异甘草素诱导前的C6胶质瘤细胞呈两极长梭形或多角形,胞质多,胞突短;而诱导后细胞突起数目不同程度增多,细胞形态变细变长。诱导前克隆形成出现早,数量多,直径大,克隆形成率高;异甘草素处理组克隆形成率降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR、Western blot结果显示,异甘草素诱导后C6细胞GFAP mRNA和蛋白表达均明显上升(P<0.01)。结论异甘草素能抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖,并能诱导C6细胞分化。

不同频率振动应变对成骨细胞增殖及分化能力的影响

目的观察不同频率振动应变（vibration strain）对体外培养成骨细胞细胞周期、增殖能力及分化的影响，确定最佳振动频率。方法应用自制复合振动仪，将振动强度0．5g（g为加速度），不同频段3～10、15～30、25～45、50～80和80～100Hz振动应变分别作用于成骨细胞，振动应变加载后分别检测细胞周期、细胞增殖能力（MTT法）及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的变化。结果15～30和25～45Hz频段诱导成骨细胞周期循环（P〈0．01），促进细胞增殖（P〈0．01），增强ALP活性（P〈0．01）；80～100和3～10Hz频段抑制细胞周期循环（P〈0．01）；80～100Hz频段抑制细胞增殖（P〈0．01）；50～80和80～100Hz频段抑制ALP活性（P〈0．01）。结论不同频率振动应变对成骨细胞周期、增殖能力、ALP活性均有影响，振动应变促进成骨细胞增殖及分化的最佳频率为15～45Hz。

白藜芦醇预处理对氧糖剥夺/再复氧损伤大鼠皮质神经干细胞增殖的影响

目的研究白藜芦醇预处理对体外氧糖剥夺/再复氧损伤大鼠皮质神经干细胞增殖的影响。方法采用悬浮培养法分离纯化新生SD大鼠大脑皮质神经干细胞。第3代贴壁培养神经干细胞氧糖剥夺150 min后,复氧培养24 h。实验分为正常组、对照组、乙醇组和不同浓度白藜芦醇预处理组。免疫荧光法鉴定细胞,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞周期及Brd U法检测细胞增殖。结果悬浮及贴壁培养细胞均高表达巢蛋白(nestin)。与对照组和乙醇组相比,不同浓度白藜芦醇预处理组(1、5、20μmol·L-1)均能明显增强细胞活力,促进细胞增殖,其中以5μmol·L-1白藜芦醇组作用最强(P<0.05)。结论白藜芦醇预处理能减轻氧糖剥夺/再复氧对神经干细胞的损伤,并促进其增殖。

改良人视网膜微血管内皮细胞原代培养及鉴定

目的建立人视网膜微血管内皮细胞的改良培养方法并研究其体外免疫组化特征。方法由人微血管片断生长出的内皮细胞首先通过CD31+免疫磁珠标记,于明胶包被培养瓶接种,采用含有20mg·L-1内皮细胞生长因子、90mg·L-1肝素、150mL·L-1马血清和100mL·L-1人血清的内皮细胞基本培养基;非内皮细胞例如周细胞可机械除杂,保留的内皮细胞克隆特征性的标志物为CD31+磁珠标记;特征通过免疫组化和激光共聚焦显微镜评价。人视网膜微血管内皮细胞的生长曲线通过MTT法测定。结果在这样的培养条件下,内皮细胞1-2d由微血管片断游出,1周可形成较大克隆,大约2周可融合成单层细胞。这些细胞证实可被CD31+磁珠附着,表达von Willebrand因子、细胞粘附蛋白CD31与CD34,并不表达α-平滑肌肌动蛋白。内皮细胞可部分混杂其他细胞,持续生长并传代。结论本研究为采用磁珠鉴定人源性视网膜微血管内皮细胞的培养及鉴定的新改良方法。本培养实验为研究人眼异常血管疾病提供了新的平台。

人视网膜微血管周细胞原代培养及鉴定

目的:建立人视网膜微血管周细胞的培养方法并研究体外其免疫组化特征。方法:由人微血管片断生长出的周细胞首先通过其形态及生长方式进行鉴别,采用含有200mL/L胎牛血清的DMEM培养基于未包被培养瓶培养;非周细胞例如色素上皮细胞可机械除杂;周细胞特征性的标志物通过免疫组化和激光共聚焦显微镜评价。人视网膜微血管周细胞的生长曲线通过MTT法测定。结果:在这样的培养条件下,周细胞1～2d由微血管片断游出,1wk可形成较大克隆,大约2wk可融合成单层细胞。这些细胞为高度不规则形,重叠生长方式,没有接触抑制;表达α-平滑肌肌动蛋白,肌动蛋白以及3G5阳性;不含有von Willebrand因子和角蛋白;周细胞可部分混杂其他细胞,纯度为99%;周细胞可持续生长并传代。结论:本研究为首次报道人源性视网膜微血管周细胞的培养及鉴定。本培养实验为研究人眼异常血管疾病提供了新的平台。

不同部位鹿茸水提液对NRK-49F细胞促增殖作用的研究

目的:研究鹿茸不同部位水提液体外对细胞促增殖作用的差异。方法:以大鼠肾成纤维细胞NRK-49F作为模型,以MTT法检测鲜鹿茸上、中、下三部分水提液的促细胞增殖率,以BCA法检测样品蛋白浓度,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析样品蛋白组成的差异。结果:上、中、下部鹿茸样品可溶性蛋白含量分别为17.89、16.04和6.89 mg·mL-1,从顶端到基部,鹿茸可溶性蛋白的含量依次降低。加样24 h时,鹿茸上部和中部样品分别在蛋白浓度800μg·mL-1和600μg·mL-1时达到最大促增殖率,分别为66.76%和64.36%,下部样品在1 000μg·mL-1时达到最大促增殖率,为58.87%。作用48 h后,鹿茸上部和中部样品均在蛋白浓度800μg·mL-1时达到最大促增殖率,分别为219.56%和215.86%,下部样品在蛋白浓度1 000μg·mL-1时达到最大促增殖率,为169.20%。鹿茸样品对细胞的增殖促进作用远大于10%胎牛血清。3个部位样品蛋白组成的SDS-PAGE图谱差异不大。结论:所有样品对细胞增殖均有促进作用,且呈现浓度依赖效应。不同部位样品主要蛋白组成差异不大。

氯化锂对人颌骨来源的骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化能力的影响

目的:探讨氯化锂(LiCl)对颌骨来源的骨髓间充质干细胞(OF-BMMSCs)增殖及骨性分化的影响。方法:采用有限稀释法克隆化培养人颌骨来源的骨髓间充质干细胞;正常培养基中加入不同浓度LiCl(5、10、20、40 mmol/L),同时设立对照组(0 mmol/L);运用MTT法分析不同浓度LiCl对人OF-BMMSCs增殖活性的影响;采用组织化学染色法、RT-PCR法测定不同浓度LiCl处理人OF-BMMSCs后的ALP活性及相关骨向分化基因(ALP,Runx-2,OCN)的表达。结果:5 mmol/L LiCl促进OF-BMMSCs增殖,对ALP、Runx-2、OCN表达的影响作用不明显(P>0.05),20和40 mmol/L LiCl抑制细胞增殖(P<0.05),促进ALP、Runx-2、OCN基因表达(P<0.05)。结论:LiCl能够促进人OF-BMMSCs的骨向分化。

不同发育阶段大鼠小肠上皮细胞c-jun、p38基因表达的特征及其与肠损伤修复的关系

目的 :研究原癌基因 c jun及其相关基因 p38在不同发育阶段大鼠小肠上皮细胞的表达分布特征 ,探讨 c jun和 p38基因在小肠创伤修复时可能发挥的生理学作用。方法 :利用超敏的链霉卵白素 (SP)免疫组织化学方法 ,观察 c jun和 p38基因在胚胎、新生及成年各时间段 Wistar大鼠小肠上皮细胞的阳性表达与分布特征。同时以细胞增殖活性的标志增殖细胞核抗原 (PCNA )表达为参照 ,对不同时期细胞的增殖分化状况作对比研究。结果 :在胚胎第 17d(E17d)、E19d及新生期第 1d(P1d)、P2 d、P7d、P14 d和 P2 8d,小肠上皮细胞c jun基因的阳性表达范围广泛 ,并且随着肠绒毛细胞的发育成熟 ,其分布从绒毛及间隙转移至绒毛上部细胞 ;在此期间 ,PCNA阳性细胞主要分布于新生绒毛底部、绒毛间隙、隐窝内的细胞 ;到成年期大鼠 ,c jun基因的表达主要在小肠绒毛顶部 ,而 PCNA阳性细胞也只局限在小肠隐窝。从 E17d至成年期 ,p38的阳性表达主要集中在绒毛间隙和陷窝内核分裂细胞。结论 :在小肠发育的早期 ,原癌基因 c jun在特定位置的高度表达 ,可能与细胞的快速分化有关 ;而其相关基因 p38的表达可能与细胞有丝分裂存在着一定的内在联系。

酸处理后甲基绿—派洛宁染色法——增殖型和分化型细胞的区别染色

0.12N HCl酸解后,再经甲基绿一派洛宁染色可以区别增殖型细胞和分亿型细胞,前者细胞核为绿色,后者紫红色,此法不须特殊仪器设备,试剂易得,是一个可为基层单位应用的组织化学方法。

电喷雾质谱结合化学计量学方法快速筛选玛咖促睾丸间质细胞增殖活性成分

应用电喷雾串联质谱法(ESI-MS/MS)对云南和秘鲁产玛咖样品中低极性化学成分进行检测,获得各样品的一级质谱指纹谱图和各离子峰的二级质谱数据,并测定各样品促进大鼠睾丸间质细胞增殖活性,采用化学计量学方法主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)和灰色关联度分析(GRA)对所获得的一级质谱数据进行处理后,可有效区分玛咖的不同产地,且筛选出其中具有促大鼠睾丸间质细胞增殖活性的可能成分,进而通过二级质谱数据分析得到可能活性成分的结构。实验结果表明,玛咖低极性成分具有很好的促大鼠睾丸间质细胞增殖活性,其中活性较强的主要为N-benzylhexadecanamide和N-benzy-(9Z,12Z,15Z)-octadecatrienamide。本方法为简单、快速分析中药中促睾丸间质细胞增殖活性成分筛选方法提供了借鉴。

发育期小鼠肾小体细胞增殖与凋亡的研究

目的研究小鼠肾小体发育过程中细胞增殖与凋亡的变化规律。方法采用PCNA免疫组织化学方法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL染色法)和光、电镜技术,对发育不同阶段肾小体的细胞增殖和凋亡进行观察。结果PCNA免疫组织化学染色显示:在Ⅰ和Ⅱ期肾小体内几乎所有细胞PCNA呈强阳性反应,Ⅲ、Ⅳ期肾小体PCNA阳性细胞数逐渐减少,Ⅴ期肾小体PCNA阳性细胞少见。TUNEL阳性细胞多出现在出生前,主要在Ⅲ、Ⅳ期肾小体表达。电镜观察:早期肾小体所有细胞核分裂象机率均高,Ⅲ期肾小体中的内皮细胞、足细胞核分裂象机率高,Ⅳ期肾小体中只见到内皮细胞核分裂象,Ⅴ期细胞核分裂象少见。电镜下所见的细胞凋亡多在Ⅲ、Ⅳ期肾小体,其中以内皮细胞、肾小囊壁层细胞凋亡居多。结论细胞增殖与凋亡行为在小鼠肾小体发育的整个过程中普遍存在,协同参与了调控肾小体正常发育过程。

胃癌骨髓微转移细胞数量与增殖性的研究

目的 :检测胃癌患者骨髓微转移 (BMM)细胞数量和增殖性 ,观察根治手术和术后化疗对其影响。 方法 :以 CK- 18作为 BMM细胞标记抗原 ,增殖细胞核抗原 (PCNA)作为细胞增殖性标记抗原 ,采用免疫组化双染法同时定量检测胃癌患者 BMM与增殖性 ,分析根治术后微转移细胞数量和增殖性的变化。 结果 :BMM细胞检出率、BMM细胞数及 BMM增殖率均与术后 TNM分期 (p TNM)相关。手术 +化疗组 BMM细胞数量和 BMM增殖率治疗后明显下降。 结论 :检测胃癌 BMM对确定肿瘤分期、预测复发及指导辅助治疗均有重要意义 。

应用苏木素法测定非单体中药提取物对细胞增殖的影响

目的建立测定非单体中药提取物对贴壁细胞增殖影响的方法。方法分别用苏木素染色法、MTT比色法及CCK-8比色法测定HUVEC细胞44 h的增殖活性,并用苏木素法、MTT比色法和CCK-8比色法检测金荞麦提取物对M21细胞增殖的影响,葡萄籽原花青素(GSP)对HUVEC细胞增殖的影响,并对不同方法进行比对。结果苏木素法检测HUVEC细胞44 h的增殖结果与CCK-8和MTT比色法结果具有一致性。在测定非单体中药提取物对贴壁细胞增殖影响方面,苏木素法与CCK-8以及MTT比色法相比具有更好的重复性和准确性。结论苏木素染色法测定非单体中药提取物对贴壁细胞增殖的影响具有稳定、简便和经济等优点。

RH株弓形虫速殖子体外入侵大鼠肠上皮细胞与增殖的动态观察

目的动态观察弓形虫RH株速殖子(简称速殖子)体外入侵大鼠肠上皮细胞(IEC-6细胞)及其增殖过程。方法取24孔培养板,设实验组及对照组各3孔,每孔放置经预处理的盖玻片。将常规传代培养的IEC-6细胞接种于各培养孔,于37℃5%CO2培养箱培养24h,吸弃培养液,实验组每孔加入1ml速殖子悬液(含1×106个速殖子),对照组每孔加入1ml无抗生素培养液,共培养。用倒置显微镜连续观察速殖子粘附、入侵IEC-6细胞及其增殖过程,并分别于共培养5～30min、1～48h后取出盖玻片,经吉氏-瑞氏染色后光镜观察其入侵和增殖情况,计算入侵率。结果共培养5min,速殖子即可入侵IEC-6细胞,随着共培养时间的延长入侵的速殖子逐渐增多,1h为1～5个,入侵率为(55.0±6.6)%。2h入侵率高达(81.8±10.2)%,有假包囊形成,速殖子可入侵细胞核并在核内增殖。4h入侵率降为(80.8±9.2)%,假包囊破裂释出成簇排列的速殖子。6h入侵率为(75.1±8.2)%,成簇排列的速殖子显著增多。12h成簇排列的速殖子减少,多数速殖子游离细胞外,完整的IEC-6细胞明显减少。24h只见部分IEC-6细胞和假包囊存在,有大量游离的速殖子。48h见大量游离速殖子,未见贴壁细胞。结论体外培养的弓形虫速殖子可迅速入侵IEC-6细胞,并可在细胞质及细胞核内增殖。增殖周期为6～12h。

Giemsa染色比色法检测晶体上皮细胞增殖

建立了一种简便、精确检测晶体上皮细胞增殖的方法──Giemsa染色比色法，基本步骤为：（1）在24孔培养板培养细胞并做影响增殖的实验；（2）75％酒精4℃固定细胞30min；（3）Giemsa染色30min；（4）10％醋酸250μl／孔脱色并转移至96孔培养板或酶标板；（5）用酶标仪540nm进行比色，吸光值（A值）高低反映细胞多少。该方法也适用于其它上皮细胞增殖的检测。

慢性炎症介导的基底膜改变在食管上皮癌变中的作用

背景与目的:基底膜对于食管上皮的分化、增殖和极性具有调节作用,其完整性的改变在上皮癌变过程中具有重要意义。本实验着重研究在食管上皮癌变过程中基底膜改变与上皮增殖的关系,探讨慢性炎症引起的基底膜改变在食管癌发生中的作用及可能机制。方法:采用过碘酸-雪夫氏(periodicacide-chiffstain,PAS)特殊染色观察200例食管癌手术标本癌旁组织、10例癌组织基底膜变化形态学类型与上皮炎症分数和增生类型的关系,对其中的51例基底膜变化典型标本进行层粘连蛋白(laminin,LN)、增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)、Ki-67免疫组织化学染色,观察LN改变与上皮细胞增殖变化的关系。结果:单纯增生、非典型增生、原位癌上皮和浸润癌基底膜可出现点状缺失、片状缺失、带状缺失、分支增厚等不同类型的形态学改变,基底膜的改变与食管上皮炎症分数具有相关性(rs=0.795,P<0.05);基底膜改变区邻近上皮细胞高表达PCNA、Ki-67(P<0.01)。结论:食管慢性炎症反应引起的基底膜改变与食管上皮细胞异常增生相关。

热炸工艺对不同部位梅花鹿鹿茸细胞增殖活性的影响

目的:考察传统热炸工艺对梅花鹿鹿茸不同部位细胞增殖活性的影响;方法:利用传统热炸法炮制东北梅花鹿鹿茸,用Bradford法测定鹿茸可溶性蛋白含量;利用MTT法测定鲜鹿茸与热炸炮制鹿茸上、中、下部位对NRK-49F细胞增殖活性的影响。结果:鲜鹿茸上中下部均具有促进细胞增殖的能力,从上到下活性减弱;热炸炮制品促细胞增殖活性降低。结论:梅花鹿鹿茸具有较强的促细胞增殖能力,传统热炸炮制明显降低鹿茸的促细胞增殖的能力。

不同体质血清影响A549肺癌细胞增殖的机理

目的探讨阴虚、阳虚和平和质3种体质血清对A549肺癌细胞生长的影响,并探讨其部分机理。方法 A549肺癌细胞经平和、阴虚、阳虚体质血清培养24,48,72 h,用MTT、流式细胞的方法分别测定平和、阴虚、阳虚体质血清对A549细胞增殖、细胞周期的变化,并用RT-PCR的方法对周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)及P16基因表达的mRNA量的分析。结果细胞培养72 h,阴虚、阳虚体质血清中的A549细胞MTT吸光度值(A)明显高于平和质;流式细胞的结果表明阴虚、阳虚体质血清培养的A549细胞的S期细胞明显高于平和质(P<0.05),而细胞周期G0/G1期的细胞低于平和质((P<0.05);RT-PCR的结果显示,CyclinD1和CDK4基因表达mRNA量均明显高于平和质((P<0.05),而P16基因表达产物均低于平和质((P<0.05)。结论阴虚、阳虚体质血清均可促进A549细胞增殖,可能的机理是提高CyclinD1、Cdk4的表达,降低P16的表达,促进细胞周期从G0/G1向S推进,从而促进细胞增殖。

骨髓间充质干细胞异体移植对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)异体移植对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用。方法全骨髓贴壁培养法获得大鼠BMSCs,流式细胞术检测细胞免疫表型,并诱导成骨方向分化。取雌性C57BL/6小鼠,随机分为3组:正常对照组、PBS组和大鼠BMSCs组,用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35~55联合完全弗氏佐剂诱导建立EAE模型。小鼠免疫后38d和48d腹腔注射PBS或大鼠BMSCs进行治疗,神经功能评分观察各组小鼠神经功能变化。二次治疗12d后取各组小鼠脊髓、脾脏和外周血。HE染色及Luxol fast blue染色观察脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失情况;脾脏制成单细胞悬液,细胞CFSE标记后10mg/L刀豆球蛋白(Con A)和MOG_(35~55)刺激培养3d,观察脾细胞增殖情况。ELISA检测大鼠BMSCs移植后外周血细胞因子干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素17(IL-17)含量。结果流式细胞术显示,大鼠BMSCs第3代(P3)细胞表达抗原CD29、CD90、CD106,不表达CD45。体外诱导其能向成骨分化。小鼠发病后,大鼠BMSCs组小鼠神经功能缺损症状较PBS组减轻,评分降低。HE染色和Luxol fast blue染色结果显示,大鼠BMSCs组脊髓炎细胞浸润和脱髓鞘比同时间点PBS组减轻(P<0.05)。Con A和MOG_(35~55)刺激培养后,PBS组和大鼠BMSCs组脾细胞增殖增加,而大鼠BMSCs组又较PBS组降低。与PBS组相比,大鼠BMSCs组血浆细胞因子IFN-γ、IL-17含量降低(P<0.05)。结论全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化BMSCs,大鼠BMSCs异体移植对小鼠EAE模型有治疗作用。

晶状体上皮细胞增生与Pax-6表达的相关分析

目的检测Pax-6基因在体外培养的不同阶段小鼠晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)中的表达,分析其与LECs增生特性的关系。方法 利用囊膜组织块贴壁法及胰酶消化法体外培养不同阶段LECs;免疫组织化学法检测LECs中Pax-6蛋白表达情况;并利用RT-PCR法检测其mRNA水平的表达情况。结果 在原代培养细胞、传第1代及传第2代的LECs中明显检测到Pax-6mRNA水平的阳性表达,LECs相应各泳道有一与227 bp相一致的扩增片段;RT-PCR法同样发现在原代培养细胞、传第1代及传第2代、传第3代的LECs中均能检测到Pax-6蛋白水平的表达,Pax-6标记指数分别为11.75%、20.00%、26.75%、5.25%,Pax-6阳性物质染色呈弥漫性、均一性分布于LECs细胞核内。阴性对照组在各阶段均未见Pax-6的表达。结论 LECs中有Pax-6基因存在,该基因的正常表达与LECs增生特性相关。