东亚三角涡虫Djtraf3基因的时空表达模式

肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)作为TRAF家族的成员之一,通过介导TLRs信号通路,参与动物的免疫反应。通过构建东亚三角涡虫Djtraf3的cDNA文库获得Djtraf3基因并分析基因结构。结果发现,该最大开放阅读框为564bp,编码的蛋白质含187个氨基酸,含有1个TRAF结构域。进化分析表明,DjTRAF3和果蝇的TRAF3聚群,位于进化树的基部;整体原位杂交结果显示,在涡虫成体及不同再生阶段,Djtraf3在整个肠部表达。这些结果为进一步探究其功能提供了依据和方向。

利用RT-PCR扩增和分析柑桔裂皮病类病毒

参考国外CEVd-A株中央保守区段(C区)和左端区段(T区),设计并合成引物Cl(-)、C2(+)、C3(+)、T1(-)、T2(+)。对感染 CEVd中国分离物的柑桔(Citrus L.)和香橼(Citrus medica L.)总核酸进行了cDNA第一链合成和PCR扩增,其中C1/C3、C1/C2分别能从感病香橼和柑桔总核酸中扩增出210bp和370bp左右的特异DNA,分别相当于CEVd的左半部和全长片段,T1/T2未能扩增出产物;健康香橼和柑桔总核酸中均未能扩增出产物。扩增结果用DIG标记的CEVd-cDNA探针进行了确证。扩增结果说明:CEVd中国分离物在左端T区与CEVd-A株存在差异。PAGE-银染法分析扩增产物表明:建立的RT-PCR方法可从约0.1ng柑桔总核酸中扩增出全长CEVd-cDNA。

基于DIG-化学发光法的Southern blot方法优化

目前,基于DIG-化学发光法的Southern blot技术已在生物实验室广泛应用,但在试验过程中经常会遇到背景黑、目的信号弱等问题,以致不能获得理想结果。在棉花线粒体基因组RFLP分析过程中结合前人经验对基于DIG-化学发光法的Southern blot技术在探针标记、探针浓度、探针剥离等方面进行了优化。优化后的方法重复性好,一张转好的尼龙膜最多可以反复使用11次;一份杂交液在两年内至少可以反复使用5次且不会明显降低杂交效果。

生物素肼化学标记和DIG标记cDNA探针检测柑桔裂皮病类病毒

分别用生物素肼化学标记和ＤＩＧ标记我国柑桔裂皮病类病毒（ＣＥＶｄ）全长克隆ｃＤＮＡ，用以上探针对不同来源的核酸样品进行斑点杂交。两种探针可检出病柑桔总核酸的最低含量约为４００ｎｇ／斑点和８０ｎｇ／斑点；生物素肼标记ＣＥＶｄ－ｃＤＮＡ探针，可检出ＣＥＶｄ－ｃＤＮＡ的最低含量约为１０ｐｇ／斑点。研制的ＣＥＶｄ检测试剂盒能检测出发病和隐性带毒苗木中的ＣＥＶｄ，灵敏、特异、简便、快速、试剂盒已被用于检测来自我国主要裂皮病病区、湖南、湖北、福建等地的柑桔和香橼材料。

猪流感病毒M基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物。应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致。本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对SI的诊断和流行病学调查。

金黄色葡萄球菌norA基因探针的制备

目的 研究制备 nor A基因介导的金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制的 Dig- nor A基因探针。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)制备 Dig- nor A基因探针。结果 PCR法制备 Dig- nor A基因探针简便易行 ,可在较短时间内获得大量的探针 ,所得探针有较高的敏感性 ;Dig- nor A基因探针安全、易操作 ,标记探针可长期保存。结论 为进一步研究 nor

PCR制备地高辛标记的探针检测禽流感病毒核酸

用聚合酶链反应 (PCR)技术 ,制备了广东禽流感无致病力分离株 A/goose/China/2 4/96 (H7N3 )核蛋白基因片段(NPc)的地高辛标记的 c DNA探针。建立并优化了检测禽流感病毒核酸的探针杂交法 ,探针杂交法能鉴别出非免疫鸡胚和SPF鸡胚尿囊液中的病毒 ,攻毒后第 3天的 SPF和非免疫鸡泄殖腔拭子中 AIV的最大检出率为 1/10 ,对临床样品中的 AIV的最大检出率为 1/7,而直接 HA和 HI法及 AGP试验检不出临床样品的 AIV。该探针具有较好的特异性和敏感性 ,为从分子水平探讨 AIV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以地高辛(DIG)标记鸡传染性支气管炎病毒(IBV)pol基因的保守片段制成核酸探针,与IBV参考株、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽流感病毒、正常鸡胚尿囊液及正常鸡肾组织等的RT-PCR产物进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与IBV毒株的RT-PCR产物杂交呈阳性,与对照病毒和组织的RT-PCR产物杂交呈阴性。敏感性试验显示,探针最低能检出约3.4pg的IBVRT-PCR产物。用该方法检测了38份疑似IBV临床病料,31份阳性;而用RT-PCR法扩增IBVS2基因确诊为阳性的只有29份。对人工接种IBV H52弱毒苗鸡咽喉和肛门拭子32份进行检测,检出15份阳性。结果表明,利用DIG探针检测IBV的RT-PCR产物,特异性和敏感性强,可重复,能克服RT-PCR非特异性反应和探针Northern杂交的不稳定性。

用人肝细胞cDNA文库制备Dig-Fas探针

为探索SLE发生、发展与Fas表达的关系 ,本文采用降落PCR技术、分子克隆技术和Fas特异性引物 ,将从人肝细胞cDNA文库中扩增的FascDNA插入T -easyvector中 ,转染JM10 9,经耐药性和lacZ插入失活筛选 ,快速细胞裂解法、限制性内切酶酶切片段和PCR扩增试验分析鉴定 ,确证获阳性转化子。然后采用地高辛化学连接标记和查见方法 ,标记扩增、分离和纯化的FascDNA ,经斑点免疫实验证实获高滴度Dig

橡胶树转基因植株Southern杂交体系的优化

以地高辛标记的Southern杂交技术已广泛应用于多个物种中。选择橡胶树为材料,就基因组DNA的提取、探针标记方法的选择以及具体的杂交操作过程等方面对该体系进行了优化。结果表明,至少40μg高质量的DNA在300μL的大酶切体系中,酶切12 h可获得良好效果;PCR法标记的探针杂交条带清晰、背景浅,其效率明显强于随机引物法标记的探针。本研究优化的体系信号强、背景浅和灵敏度高,为橡胶树Southern杂交鉴定分析提供参考。

大鼠脑组织中p75基因克隆及其探针制备

为了克隆大鼠p75基因并制备地高辛标记的p75 cDNA探针(dig-p75 cDNA),本研究采用RT-PCR法,从大鼠脑组织mRNA中扩增p75基因mRNA部分片段,克隆入T载体,并经序列测定。以dig-p75 cDNA为探针,采用原位杂交方法观察成年SD大鼠海马组织中p75 mRNA的表达。结果:RT-PCR法扩增出一种特异产物与预期长度386 bp相符,T载体克隆测序与p75基因100％同源。原位杂交结果显示,阳性信号出现在成年大鼠海马组织中。结论:采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织p75基因克隆,dig-p75 cDNA探针原位杂交显示正常SD大鼠海马组织中表达p75 mRNA。

DIG标记罗非鱼DNA指纹图谱研究

运用 Hae / 33.6、Hae / 33.15、Hinf / 33.6、Hinf / 33.154种限制酶 /探针组合对奥利亚罗非鱼、美国尼罗罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼三种群体罗非鱼进行非放射性 DNA指纹图谱研究 ,结果表明在三种罗非鱼群体中 4种限制酶 /探针组合都能产生具有种属特异性和个体特异性的 DNA指纹图谱 .Hae / 33.6、Hae / 33.15组合中奥利亚罗非鱼特有的强阳性杂交图带可作为鉴别奥利亚罗非鱼的分子遗传标记 .4种限制酶 /探针组合在奥利亚罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼、美国尼罗罗非鱼检出的个体平均图带数分别为 8.72 6、8.0 86和 6 .975.4种限制酶 /探针组合在奥利亚罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼、美国尼罗罗非鱼检出的多态性位点比例分别为 6 2 .95%、96 .31%和85.2 6 % .

应用DIG标记探针杂交检测IBDV

本试验用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ＤＩＧ）标记的探针建立了核酸杂交检测传染性法氏囊病病毒（ＩＢ－ＤＶ）的方法，并在敏感性方面同琼脂扩散试验进行了比较。探针来源于ＩＢＤＶＳＴＣ－ｌｌ９和ＳＴＣ－２４３ｃＤＮＡ。杂交方法的敏感性试验表明，核酸杂交可以检测到０．１ｐｇ的ＩＢＤＶＲＮＡ；与多个毒株核酸的杂交则显示出标记的探针可以作为通用试剂用于ＩＢＤＶ早期感染的诊断；而同琼脂扩散试验的比较则说明，杂交方法比常规的免疫沉淀反应敏感１０４倍以上。除此之外，由于杂交方法特异以及非放射性探针操作方便，因而具有很大的应用前景。

双歧杆菌地高辛标记寡核苷酸基因探针制备和应用研究

目的探讨地高辛标记寡核苷酸基因探针应用于微生态研究的可行性和实用性。方法制备双歧杆菌属和部分种的地高辛标记16S rRNA寡核苷酸探针,初步应用于微生态制剂鉴定和临床肠道微生态检测,评价寡核苷酸探针杂交在肠道微生态研究和检测中的应用价值。结果地高辛标记寡核苷酸探针具有较好的特异性与灵敏度:地高辛标记的双歧杆菌属和种的共6种寡核苷酸基因探针与标准菌株杂交后灵敏度和特异度分别为属探针95%、75%,青春双歧87.5%、90%,两歧双歧87.5%、87.5%,短双歧87.5%、92.5%,婴儿双歧75%、95%,长双歧75%、100%。结论寡核苷酸基因探针用于肠道细菌的鉴定显示出一定前景,加大探针的种类与扩大调查范围有可能使该技术替代现有细菌培养技术。

人IL-2RαcDNA探针制备及在肾移植中的应用初探

从质粒pBSR中分离出人IL-2RacDNA片段,长0.9kb,应用地高辛配基标记此片段,制备成人IL-2RacDNA探针。该探针特异性强,敏感性可达到检测1.5pg同源DNA或RNA,且无放射性污染等。用此探针连续检测5例肾移植病人外周血淋巴细胞mRNA,结果显示:术前IL-2RamRNA均很低,术后肾功能稳定者也处于很低水平,2例出现排斥反应者IL-2RamRNA明显升高。

转基因油菜地高辛标记DNA探针杂交检测方法的建立

通过PCR扩增法制备转基因油菜外源筛选基因FMV35S启动子的DIG-11-dUTP标记DNA探针,与该基因PCR扩增产物进行Southern杂交,通过显色反应对商品化转基因油菜进行检测。本研究对反应基片带正电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜进行了比较,并比较了不同固定条件和杂交条件下的杂交结果。尼龙膜较之硝酸纤维素膜可更好的结合DNA片段,经紫外线照射交联5 分钟,与含甲酰胺的杂交液在45℃杂交30 min结果较为理想。

PCR制备地高辛素标记的探针检测轮状病毒核酸

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，制备了轮状病毒第９基因部分片段的地高辛标记的ｃＤＮＡ探针。ＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交表明该探针具有轮状病毒Ａ组的特异性，可检出１０ｐｇＨＲＶ－ＲＮＡ。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交，两种方法的结果一致；同时将斑点杂交法与ＰＡＧＥ法的结果进行了比较。实验结果表明用ＰＣＲ技术直接制备地高辛索标记的ｃＤＮＡ探针具有方便、快速、标记率高、特异性强的特点，具有一定的应用前景。

地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的 制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法 采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果 RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论 采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。

大鼠脑组织中CNTF基因克隆及其探针制备

目的 克隆大鼠CNTF基因并制备地高辛标记的CNTF探针。方法 采用RT PCR法 ,从大鼠脑组织mRNA中扩增CNTF基因ORF区片段 ,克隆入T载体 ,并经序列测定。以地高辛素标记CNTF基因片段为探针 ,对成年大鼠脊髓组织切片进行原位杂交。结果 RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 6 16bp相符 ,序列测定与CNTF基因 10 0 %同源。原位杂交显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓白质的前索及侧索的周边部分 ,为杵棒形和三角形带有纤细突起的胶质细胞。结论 采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的CNTF基因克隆 ,地高辛标记的CNTF探针原位杂交显示正常大鼠脊髓白质的部分胶质细胞中表达CNTFmRNA。

PCR-DIG探针斑点杂交法快速检测SRY基因

以正常男性ＤＮＡ作为模板，用本文设计的ＳＲＹ基因的１对引物组合进行ＰＣＲ法制备ＤＩＧ探针，然后通过低熔点琼脂糖电泳回收将扩增产物纯化，得到ＳＲＹ基因探针。与其他制备探针的方法相比，此方法制得的探针产量和标记效率都很高，标记灵敏度达００１ｐｇ，片段长度均一，为２９０ｂｐ。在ＤＮＡ斑点杂交检测ＳＲＹ基因时显示了很好的特异性，显示这种方法可以同时对大量性反转病例进行临床检测。