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Droplet digital polymerase chain reaction assay for methylated ring finger protein 180 in gastric cancer 被引量:1
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作者 Guang-Hong Guo Yi-Bin Xie +1 位作者 Tao Jiang Yang An 《World Journal of Gastrointestinal Oncology》 SCIE 2022年第10期2038-2047,共10页
BACKGROUND Gastric cancer(GC)is one of the most prevalent malignant tumors that endangers human health.Early diagnosis is essential for improving the prognosis and survival rate of GC patients.Ring finger protein 180(... BACKGROUND Gastric cancer(GC)is one of the most prevalent malignant tumors that endangers human health.Early diagnosis is essential for improving the prognosis and survival rate of GC patients.Ring finger protein 180(RNF180)is involved in the regulation of cell differentiation,proliferation,apoptosis,and tumorigenesis,and aberrant hypermethylation of CpG islands in the promoter is strongly associated with the occurrence and development of GC.Thus,methylated RNF180 can be used as a potential biomarker for GC diagnosis.AIM To use droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR)to quantify the methylation level of the RN180 gene.A reproducible ddPCR assay to detect methylated RNF180 from trace DNA was designed and optimized.METHODS The primer and probe were designed and selected,the conversion time of bisulfite was optimized,the ddPCR system was adjusted by primer concentration,amplification temperature and amplification cycles,and the detection limit of ddPCR was determined.RESULTS The best conversion time for blood DNA was 2 h 10 min,and that for plasma DNA was 2 h 10 min and 2 h 30 min.The results of ddPCR were better when the amplification temperature was 56°C and the number of amplification cycles was 50.Primer concentrations showed little effect on the assay outcome.Therefore,the primer concentration could be adjusted according to the reaction system and DNA input.The assay required at least 0.1 ng of input DNA.CONCLUSION In summary,a ddPCR assay was established to detect methylated RNF180,which is expected to be a new diagnostic biomarker for GC. 展开更多
关键词 Gastric cancer Ring finger protein 180 DNA methylation Droplet digital polymerase chain reaction
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Development of a droplet digital polymerase chain reaction assay for the sensitive detection of total and integrated HIV-1 DNA
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作者 Lin Yuan Zhiying Liu +13 位作者 Xin Zhang Feili Wei Shan Guo Na Guo Lifeng Liu Zhenglai Ma Yunxia Ji Rui Wang Xiaofan Lu Zhen Li Wei Xia Hao Wu Tong Zhang Bin Su 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 2024年第6期729-736,共8页
Background:Total human immunodeficiency virus(HIV)DNA and integrated HIV DNA are widely used markers of HIV persistence.Droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR)can be used for absolute quantification without n... Background:Total human immunodeficiency virus(HIV)DNA and integrated HIV DNA are widely used markers of HIV persistence.Droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR)can be used for absolute quantification without needing a standard curve.Here,we developed duplex ddPCR assays to detect and quantify total HIV DNA and integrated HIV DNA.Methods:The limit of detection,dynamic ranges,sensitivity,and reproducibility were evaluated by plasmid constructs containing both the HIV long terminal repeat(LTR)and human CD3 gene(for total HIV DNA)and ACH-2 cells(for integrated HIV DNA).Forty-two cases on stable suppressive antiretroviral therapy(ART)were assayed in total HIV DNA and integrated HIV DNA.Correlation coefficient analysis was performed on the data related to DNA copies and cluster of differentiation 4 positive(CD4^(+))T-cell counts,CD8^(+)T-cell counts and CD4/CD8 T-cell ratio,respectively.The assay linear dynamic range and lower limit of detection(LLOD)were also assessed.Results:The assay could detect the presence of HIV-1 copies 100%at concentrations of 6.3 copies/reaction,and the estimated LLOD of the ddPCR assay was 4.4 HIV DNA copies/reaction(95%confidence intervals[CI]:3.6-6.5 copies/reaction)with linearity over a 5-log_(10)-unit range in total HIV DNA assay.For the integrated HIV DNA assay,the LLOD was 8.0 copies/reaction(95%CI:5.8-16.6 copies/reaction)with linearity over a 3-log 10-unit range.Total HIV DNA in CD4^(+)T cells was positively associated with integrated HIV DNA(r=0.76,P<0.0001).Meanwhile,both total HIV DNA and integrated HIV DNA in CD4^(+)T cells were inversely correlated with the ratio of CD4/CD8 but positively correlated with the CD8^(+)T-cell counts.Conclusions:This ddPCR assay can quantify total HIV DNA and integrated HIV DNA efficiently with robustness and sensitivity.It can be readily adapted for measuring HIV DNA with non-B clades,and it could be beneficial for testing in clinical trials. 展开更多
关键词 Human immunodeficiency virus HIV Integrated HIV-1 DNA Total HIV DNA Droplet digital polymerase chain reaction HIV reservoir Antiretroviral therapy
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Micro-droplet Digital Polymerase Chain Reaction and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Technologies Provide Highly Sensitive and Accurate Detection of Zika Virus 被引量:6
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作者 Yuan Hui Zhiming Wu +12 位作者 Zhiran Qin Li Zhu Junhe Liang Xujuan Li Hanmin Fu Shiyu Feng Jianhai Yu Xiaoen He Weizhi Lu Weiwei Xiao Qinghua Wu Bao Zhang Wei Zhao 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2018年第3期270-277,共8页
The establishment of highly sensitive diagnostic methods is critical in the early diagnosis and control of Zika virus(ZIKV)and in preventing serious neurological complications of ZIKV infection. In this study, we esta... The establishment of highly sensitive diagnostic methods is critical in the early diagnosis and control of Zika virus(ZIKV)and in preventing serious neurological complications of ZIKV infection. In this study, we established micro-droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR) and real-time quantitative PCR(RT-qPCR) protocols for the detection of ZIKV based on the amplification of the NS5 gene. For the ZIKV standard plasmid, the RT-qPCR results showed that the cycle threshold(Ct) value was linear from 10~1 to 10~8 copy/l L, with a standard curve R^2 of 0.999 and amplification efficiency of 92.203%;however, a concentration as low as 1 copy/l L could not be detected. In comparison with RT-qPCR, the dd PCR method resulted in a linear range of 10~1–10~4 copy/l L and was able to detect concentrations as low as 1 copy/l L. Thus, for detecting ZIKV from clinical samples, RT-qPCR is a better choice for high-concentration samples(above 10~1 copy/l L),while ddPCR has excellent accuracy and sensitivity for low-concentration samples. These results indicate that the ddPCR method should be of considerable use in the early diagnosis, laboratory study, and monitoring of ZIKV. 展开更多
关键词 Zika virus Nucleic acid detection - Micro-droplet digital polymerase chain reaction (ddpcr)Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)
原文传递
SMRT sequencing and ddPCR reveal the complexity of developmental trajectories and temporal dynamics of gut bifidobacterial communities in infants
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作者 Xu Gao Tao Zhang +5 位作者 Xiaoye Bai Qiannan Wen Dongyu Li Lai-Yu Kwok Heping Zhang Zhihong Sun 《Food Science and Human Wellness》 SCIE CSCD 2023年第5期1743-1750,共8页
Infant intestinal microbiome is closely linked with health and risk of disease. Bifidobacterium are important components of the infant gut and are known to confer various health effects on the host. However, few studi... Infant intestinal microbiome is closely linked with health and risk of disease. Bifidobacterium are important components of the infant gut and are known to confer various health effects on the host. However, few studies have described the precise composition and dynamics of early infant gut bifidobacterial communities. Thus, this was a pilot study aiming to describe the developmental trajectories and temporal dynamics of bifidobacterial communities in infants before 6 months of age. A total of 28 fecal samples from 4 infants(GF, ZZ, QM, TN, respectively)were collected and analyzed after 5, 15, 30, 60, 90, 120, 150, and 180 days of birth by a bifidobacteria-target method(based on single-molecule real-time sequencing of partial bifidobacterial rpsK genes)in conjunction with droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR). The infant fecal microbiota comprised a total of 11 bifidobacterial species, including 4 major species, i.e., B. dentium(37.35%), B. catenulatum(32.04%), B. breve(22.24%), and B. animalis(8.02%). The infant microbiota showed highly individualized developmental trajectories. The leading species for GF was B. catenulatum, with a relatively stable developmental trajectory. In ZZ, B. breve was enriched, and the developmental trajectory was rather fluctuating. The most abundant species for QM and TN was B. dentium. The developmental trajectory of B. dentium in QM showed a trend of gradual decrease, whereas an opposite trend was seen in samples of TN. The results of ddPCR confirmed large variations in quantities of bifidobacteria between infants and suggested discordances in temporal dynamics of bifidobacterial communities during the first half year of infancy. In conclusion, our results suggested that the early infant gut bifidobacterial microbiota was highly complex and temporal dynamics, with individualized developmental trajectories, which should be considered in future research of infant gut microbiota. 展开更多
关键词 INFANTS Gut microbiota BIFIDOBACTERIUM Diversity Single-molecule real-time(SMRT)sequencing Droplet digital polymerase chain reaction
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土壤固碳微生物的绝对定量检测实验设计
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作者 付小花 陈皓 +2 位作者 张华 周磊 唐贤春 《实验室研究与探索》 CAS 北大核心 2024年第4期18-22,共5页
为了定量检测土壤中的固碳微生物,设计以功能基因cbbL为靶标的固碳微生物微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法。选择合适的引物探针,从退火温度、探针浓度以及引物浓度进行反应条件的优化,分析ddPCR检测方法的线性范围、敏感性、重... 为了定量检测土壤中的固碳微生物,设计以功能基因cbbL为靶标的固碳微生物微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法。选择合适的引物探针,从退火温度、探针浓度以及引物浓度进行反应条件的优化,分析ddPCR检测方法的线性范围、敏感性、重复性和特异性。结果显示,当退火温度为55.8℃、探针与引物浓度分别为350、750 nmol/L时,建立的cbbL-ddPCR扩增反应效率最高,阴阳性微滴分布界限最明显,平均拷贝数较高;检测的线性范围为2.3×10^(0)~2.3×10^(5)copies/μL-DNA,曲线方程y=0.1077x-95.562,相关系数R^(2)为0.9997,检出限为0.5 copy/μL-DNA,21个重复的变异系数仅为3.92%,与其他4种非固碳微生物DNA未发生交叉反应。所建立的cbbL-ddPCR方法可用于土壤微生物固碳潜能测定。 展开更多
关键词 微滴数字聚合酶链式反应 固碳微生物 cbbL基因 反应条件优化
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数字聚合酶链式反应技术在食品安全核酸检测领域中的研究进展及标准化现状 被引量:1
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作者 秦爱 王娟 +4 位作者 邓方进 余秋地 周朝旭 李根容 肖昭竞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第18期350-360,共11页
数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)是一种新型核酸扩增技术,无需借助内参基因和标准曲线,通过极限稀释和泊松分布统计即可实现核酸单分子层面的绝对定量分析,具有高灵敏度、高精确度和高耐受性等技术优势,在... 数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)是一种新型核酸扩增技术,无需借助内参基因和标准曲线,通过极限稀释和泊松分布统计即可实现核酸单分子层面的绝对定量分析,具有高灵敏度、高精确度和高耐受性等技术优势,在食品安全核酸检测领域具有极大的发展潜力。本文介绍了dPCR的技术原理、优缺点及商业化平台,综述了dPCR在食源性致病菌检测、动物和植物源性成分检测、转基因成分检测和食源性病毒检测等领域的研究进展及标准化现状,并分析了该技术存在的技术难题和未来发展方向,以期为dPCR在食品安全核酸检测领域中的应用推广和标准制定提供研究思路。 展开更多
关键词 数字聚合酶链式反应 食品安全 标准化
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改进的K-Means高通量dPCR荧光图像分类算法 被引量:2
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作者 孙刘杰 庞茂然 《包装工程》 CAS 北大核心 2022年第7期244-253,共10页
目的 为实现高通量dPCR荧光图像阳性点高精确度分类,提出一种改进的K-means高通量dPCR荧光图像分类算法。方法 首先,将预处理后的荧光图像进行像素灰度值统计,依据图像亮度自适应选择波峰波谷作为聚类中心,通过马氏距离度量确定像素簇类... 目的 为实现高通量dPCR荧光图像阳性点高精确度分类,提出一种改进的K-means高通量dPCR荧光图像分类算法。方法 首先,将预处理后的荧光图像进行像素灰度值统计,依据图像亮度自适应选择波峰波谷作为聚类中心,通过马氏距离度量确定像素簇类;然后,将粗分类结果进行开、闭运算及删除小面积对象等形态学处理;最后,利用3次连通域统计方法完成细分类、位置标识和计数。结果 选取4种通道825幅荧光图像进行检验,平均精确率达到99.06%,召回率达到98.97%,分类效果良好。结论 文中提出的改进K-means分类算法可以实现对高通量dPCR荧光图像的高精度分类和计数,对其他荧光图像分类识别具有一定借鉴意义。 展开更多
关键词 dpcr 荧光图像 K均值 阳性点计数
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双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系
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作者 孙敏 高宏伟 +3 位作者 王金花 李瑞 张倩 林青宇 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第12期20-26,共7页
目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建... 目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量限、检测准确度进行评估。结果该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于0.86%~22.90%,线性决定系数r^(2)>0.99;品系特异性基因的定量限为3拷贝;不同浓度样品EH92-527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和–1.31。结论方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。 展开更多
关键词 转基因马铃薯 双重数字聚合酶链式反应 定量检测
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数字PCR技术检测结核分枝杆菌的应用进展
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作者 林依婷 周春妹(综述) 郭玮(审校) 《国际检验医学杂志》 CAS 2024年第14期1756-1760,1766,共6页
结核病是一种全球范围内的慢性传染病,对人类健康已构成严重威胁,早期诊断、耐药筛查和控制疾病传播是结核病防治的关键方面,然而,现有的诊断技术和药敏试验耗时长,难以实现早期诊断和耐药筛查的目的,大大限制了对疾病传播的控制。数字... 结核病是一种全球范围内的慢性传染病,对人类健康已构成严重威胁,早期诊断、耐药筛查和控制疾病传播是结核病防治的关键方面,然而,现有的诊断技术和药敏试验耗时长,难以实现早期诊断和耐药筛查的目的,大大限制了对疾病传播的控制。数字聚合酶链反应(dPCR)是第3代PCR,是一种灵敏度高、不需要校正曲线的核酸定量检测方法。该文就dPCR的原理及其在结核病诊断、耐药筛查和传播监测中的应用进行综述,并将dPCR与其他结核病检测方法进行比较,展望了dPCR在临床结核病实验室应用中的挑战和未来的前景。 展开更多
关键词 数字聚合酶链反应 结核病 结核分枝杆菌 耐药基因
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微滴式数字聚合酶链式反应在血流感染快速诊断中的性能评价及应用
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作者 李贵玲 刘春梅 任传利 《实用临床医药杂志》 CAS 2024年第12期7-11,17,共6页
目的使用临床菌株和标准菌株验证微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)试剂检测性能,并评估ddPCR技术临床应用的有效性和实用性。方法使用临床菌株和标准菌株验证ddPCR试剂盒符合率、特异度、精密度、最低检出限等。收集74例疑似血流感染患... 目的使用临床菌株和标准菌株验证微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)试剂检测性能,并评估ddPCR技术临床应用的有效性和实用性。方法使用临床菌株和标准菌株验证ddPCR试剂盒符合率、特异度、精密度、最低检出限等。收集74例疑似血流感染患者的血液样本,同时采用ddPCR和血培养2种方法测定患者血液标本的病原体。结果ddPCR血流感染病原体检测的平均检测时间为3.5 h,能够同时检测十几种常见病原体,ddPCR血流感染病原体检测试剂盒的符合率、特异度、精密度、最低检测限均满足临床要求。疑似血流感染的74例患者中,采用ddPCR方法检测的阳性率为64.86%,采用血培养检测的阳性率为40.54%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ddPCR可快速﹑批量﹑高效地检测血流感染常见病原体,检测性能可以满足临床需要,血培养联合ddPCR技术检测血流感染有利于临床血流感染患者的早期快速诊断。 展开更多
关键词 微滴式数字聚合酶链式反应 血流感染 血培养 病原体
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数字聚合酶链反应技术对甲状腺结节术前良恶性的鉴别诊断价值
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作者 胡静雯 魏丽荣 +1 位作者 滕小艳 杜玉珍 《检验医学与临床》 CAS 2024年第17期2537-2541,共5页
目的探讨数字聚合酶链反应(dPCR)技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。方法收集2019年6月至2022年9月在该院进行超声引导下细针穿刺细胞学检查(FNAC)且接受手术治疗的甲状腺结节患者穿刺液标本141份,采用dPCR和扩增阻滞突变系... 目的探讨数字聚合酶链反应(dPCR)技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。方法收集2019年6月至2022年9月在该院进行超声引导下细针穿刺细胞学检查(FNAC)且接受手术治疗的甲状腺结节患者穿刺液标本141份,采用dPCR和扩增阻滞突变系统(ARMS)-PCR检测BRAF V600E基因突变,dPCR同时检测NRAS Q61R基因突变、TERT基因启动子C228T和C250T突变。以患者术后病理检测结果为金标准,比较几种方法的准确率,评价dPCR技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。结果141份穿刺液标本中,dPCR对BRAF V600E的检出率为69.50%(98/141),ARMS-PCR对BRAF V600E的检出率为64.54%(91/141),差异有统计学意义(P<0.05);dPCR检测NRAS Q61R、TERT C228T、TERT C250T在甲状腺乳头状癌(PTC)中的突变检出率分别为15.32%(17/111)、12.61%(14/111)和1.80%(2/111)。单独使用dPCR检测BRAF V600E鉴别诊断甲状腺结节良恶性的准确率为89.36%,明显高于ARMS-PCR(84.40%)和FNAC(77.30%),差异均有统计学意义(P<0.05)。dPCR(BRAF V600E)+FNAC的诊断准确率为97.16%,dPCR多基因[BRAF V600E+NRAS Q61R+TERT(C228T+C250T)]+FNAC的诊断准确率为97.87%,均高于单独dPCR(BRAF V600E)、dPCR(多基因)的诊断准确率,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论dPCR可检测出ARMS-PCR漏检的基因突变位点,也可以弥补FNAC的不足,该技术联合FNAC可提高甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断的效能。 展开更多
关键词 数字聚合酶链反应 甲状腺结节 术前诊断 BRAF V600E 甲状腺乳头状癌
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数字聚合酶链式反应技术在食品安全核酸检测中的研究进展
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作者 桂明明 于武华 +1 位作者 冯露 许建丰 《食品安全导刊》 2024年第32期153-157,161,共6页
数字聚合酶链式反应(Digital Polymerase Chain Reaction,dPCR)技术是一种新兴的核酸绝对定量分析技术,无须标准品和绘制标准曲线,通过极限稀释样品和泊松概率分布原理就可以精准检测样本初始的DNA拷贝数,具有特异性强、灵敏度高和重复... 数字聚合酶链式反应(Digital Polymerase Chain Reaction,dPCR)技术是一种新兴的核酸绝对定量分析技术,无须标准品和绘制标准曲线,通过极限稀释样品和泊松概率分布原理就可以精准检测样本初始的DNA拷贝数,具有特异性强、灵敏度高和重复性好的特性,在食品安全核酸检测领域具有较好的发展潜力。本文介绍了dPCR技术的基本原理和特点,分析了dPCR技术在食品安全核酸检测领域的研究现状,并对其在食品安全中的应用前景进行展望,以期为促进dPCR在食品安全核酸检测领域中的应用提供一定参考。 展开更多
关键词 数字聚合酶链式反应(dpcr) 食品安全 核酸检测 绝对定量
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建立大规模筛选病毒的核酸检测方法
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作者 梁雪 石云峰 张经纬 《医学研究杂志》 2024年第4期24-29,共6页
目的 开发快速、简便、可大规模对病毒进行筛选的核酸检测方法。方法 通过集液滴生成、循环扩增、信号读取为一体的液滴数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)系统,以严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe... 目的 开发快速、简便、可大规模对病毒进行筛选的核酸检测方法。方法 通过集液滴生成、循环扩增、信号读取为一体的液滴数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)系统,以严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)的ORF1ab和N基因为靶序列,以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参基因,进行核酸扩增并监测每个液滴的荧光信号。结果 一体式DDPCR仪实现了“样本进-结果出”的简易操作。其水油体系与SARS-CoV-2检测试剂盒中试剂兼容,至扩增结束液滴稳定未融合,实现了实时检测区分出大量液滴中不同的荧光信号。恒温扩增条件下,最早可在第9min观察到带有三重荧光信号(FAM、HEX、CY5)的液滴。扩增过程中的实时荧光信号通过拟合后与实时荧光定量聚合酶链反应扩增曲线类似,包括基线期、指数期和平台期。各基因几百个液滴的扩增曲线显示,各液滴中无特异性扩增,同时Ct值分析结果显示,最早可在第12min得到扩增信号,达到鉴别目的。结论 一体式ddPCR仪操作简便,液滴中反应迅速,可达到快速检测的目的。恒温扩增对反应设备要求较低,可大规模批量反应,同时拍照式信号采集可记录大量液滴的荧光信号,达到大规模筛选的目的。 展开更多
关键词 一体式液滴数字聚合酶链反应 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 恒温扩增
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利用微滴数字PCR仪定量检测贝类中两种弧菌方法的建立
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作者 聂丹丹 丁旭 +4 位作者 姜佳颖 于淼淼 李爱军 李玲 罗雁非 《现代科学仪器》 2024年第1期48-53,共6页
建立贝类中霍乱弧菌和副溶血性弧菌微滴数字聚合酶链式反应快速精准定量检测方法,评价其可行性。采用SN/T 2425-2010和SN/T 2424-2010的引物和探针,建立双重微滴数字PCR反应体系。霍乱弧菌和副溶血性弧菌双重微滴数字PCR的最低检测限度... 建立贝类中霍乱弧菌和副溶血性弧菌微滴数字聚合酶链式反应快速精准定量检测方法,评价其可行性。采用SN/T 2425-2010和SN/T 2424-2010的引物和探针,建立双重微滴数字PCR反应体系。霍乱弧菌和副溶血性弧菌双重微滴数字PCR的最低检测限度分别可达到2.9 copies/μL和1.7 copies/μL,相当于1×10^(5)CFU/mL纯菌液,所建立的双重微滴数字PCR检测方法具有特异性和灵敏性,重复性试验结果也很稳定,不与其他常见病原菌发生交叉反应。本研究建立的双重微滴数字PCR方法可有效定量检测贝类样品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌。 展开更多
关键词 微滴数字PCR 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 定量检测
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一种基于双重ddPCR的肉制品中牛源性成分的定量分析方法 被引量:5
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作者 熊苏玥 李家鹏 +7 位作者 李金春 韦忆萱 许随根 刘睿茜 陈曦 王守伟 曲超 乔晓玲 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第24期318-324,共7页
将低价肉类原料掺入高价肉制品是一种典型的肉类掺假方式,为准确鉴别牛肉及牛肉制品的真伪,建立一种基于双重微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)的牛源性成分定量分析方法。通过对14种动物的Be... 将低价肉类原料掺入高价肉制品是一种典型的肉类掺假方式,为准确鉴别牛肉及牛肉制品的真伪,建立一种基于双重微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)的牛源性成分定量分析方法。通过对14种动物的Beta-actin单拷贝基因序列进行分析,设计牛源性特异性引物、探针与动物源性成分通用引物、探针并建立双重ddPCR体系,推导出牛源性成分质量与其特异性扩增拷贝数之间的计算公式,对牛源性成分进行定量检测该方法得到牛源性成分质量M_(牛)(mg)与其特异性扩增拷贝数浓度C_(牛)(copies/μL)之间的计算公式为M_(牛)=0.033C_(牛)+2.37,对已知牛肉质量的混合肉样品与不同部位的牛肉样品进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致。同时拷贝数相对含量可辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假。对市售样品的检测发现,存在目标肉样含量不达标以及不同程度的动物源性成分等掺假现象,说明该检测方法可为牛肉制品掺假量化判定和混合源性产品分级鉴定提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛源性成分 双重微滴式数字聚合酶链式反应 定量检测 肉类掺假
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数字聚合酶链反应(dPCR)技术在病原体基因检测应用中的研究进展 被引量:2
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作者 唐月明 伊洁 《现代检验医学杂志》 CAS 2021年第5期174-179,共6页
实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)的准确度和精密度容易受到很多因素的影响,数字聚合酶链反应(dPCR)作为一种新的分子定量技术,以其更高的敏感度、精密度、独立于标准曲线及更高的抗干扰能力等优点,近年来在病原体基因检测中逐渐兴起。... 实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)的准确度和精密度容易受到很多因素的影响,数字聚合酶链反应(dPCR)作为一种新的分子定量技术,以其更高的敏感度、精密度、独立于标准曲线及更高的抗干扰能力等优点,近年来在病原体基因检测中逐渐兴起。该文将dPCR技术的特点、优势、不足及在病原体检测中的应用进行综述。 展开更多
关键词 数字聚合酶链反应 病原体 绝对定量
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水产品中创伤弧菌ddPCR定量方法的建立 被引量:3
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作者 马丹 魏咏新 +6 位作者 李丹 魏海燕 徐蕾蕊 汪琦 付溥博 张西萌 曾静 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第12期305-311,共7页
选取创伤弧菌单拷贝基因met为靶基因,设计引物探针,建立对创伤弧菌准确定量的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法,并进行特异性、灵敏度和重复性实验,同时与实时PCR(real-time PCR)方法进... 选取创伤弧菌单拷贝基因met为靶基因,设计引物探针,建立对创伤弧菌准确定量的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法,并进行特异性、灵敏度和重复性实验,同时与实时PCR(real-time PCR)方法进行比较。结果显示,所建立的ddPCR方法可以快速、高效地检测出创伤弧菌,细菌纯培养物中其定量限可达323拷贝数/mL,检测限可达61拷贝数/mL,人工污染牡蛎样品中能最低能检测到1.13×10^2拷贝数/g的目标菌。对人工污染样品中目标菌的检测,ddPCR的定量结果约为平板计数结果的1.4倍,比real-time PCR方法的检测更加稳定准确。本研究建立的ddPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测创伤弧菌。 展开更多
关键词 微滴数字聚合酶链式反应 创伤弧菌 实时荧光聚合酶链式反应
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微滴式数字PCR(ddPCR)快速检测α珠蛋白基因ααα^(anti-3.7)三联体 被引量:1
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作者 龚小倩 杨学煌 +2 位作者 乔伶俐 陈亚军 周万军 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1265-1269,共5页
目的建立一种基于微滴式数字PCR(ddPCR)技术的α珠蛋白基因αααanti-3.7快速检测方法。方法以β-actin为参比基因、α1基因X1/Y1盒之间的差异性序列为目的基因代表性扩增子,设计特异性引物和Taq Man探针,建立基于ddPCR技术的拷贝数定... 目的建立一种基于微滴式数字PCR(ddPCR)技术的α珠蛋白基因αααanti-3.7快速检测方法。方法以β-actin为参比基因、α1基因X1/Y1盒之间的差异性序列为目的基因代表性扩增子,设计特异性引物和Taq Man探针,建立基于ddPCR技术的拷贝数定量方法;检测28例已知基因型和60例临床样本,评价此方法的灵敏度和准确性。结果采用本研究建立的方法,28例已知基因型样本的检测结果均与靶基因型结果相符;60例临床样本中检出5例αα/αααanti-3.7,与MLPA的验证结果一致;方法学评价结果显示此ddPCR体系的灵敏度与准确性均达100%。结论建立了一种α珠蛋白基因αααanti-3.7三联体ddPCR检测方法,操作简单快速、结果准确可靠,可应用于人群筛查和临床常规分子诊断。 展开更多
关键词 数字PCR 珠蛋白基因 多拷贝 地中海贫血
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A群轮状病毒一步法RT-ddPCR方法的建立 被引量:2
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作者 徐蕾蕊 马丹 +8 位作者 魏咏新 李丹 魏海燕 刘莉 张西萌 汪琦 付溥博 赵晓娟 曾静 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第12期292-297,共6页
目的:建立A群轮状病毒(rotavirus,RV)一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法。方法:筛选特异性引物探针,建立并优化一步法RT-ddPCR方法,确定特异性;制... 目的:建立A群轮状病毒(rotavirus,RV)一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法。方法:筛选特异性引物探针,建立并优化一步法RT-ddPCR方法,确定特异性;制备含A群RV目的片段的RNA标准物质,确定建立方法的检测限、准确度、重复性和复现性。A群RV阳性粪便样品梯度稀释后制作染毒液,制备人工染毒样品,分离病毒与食品基质,浓缩得到病毒悬液,提取RNA后,比较不同食品基质中一步法RT-ddPCR检测结果。结果:建立的一步法RT-ddPCR方法定量限为58000.00~5.80拷贝/μL,具有良好的特异性、准确性、灵敏度、重复性和复现性。各染毒水平下A群RV检出量和回收率在不同食品基质中存在显著性差异(P<0.05)。结论:研究建立的一步法RT-ddPCR方法可准确定量A群RV RNA,食品基质可影响一步法RT-ddPCR检测结果,通过病毒回收率可计算食品中A群RV的实际载量。 展开更多
关键词 A群轮状病毒 一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应 定量检测 食品基质
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高通量dPCR基因芯片荧光激发测控系统的研制
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作者 李龙成 孙刘杰 陆春生 《光学仪器》 2019年第6期71-78,共8页
为了解决高通量数字聚合酶链式反应(dPCR)基因芯片荧光激发问题,设计了一套荧光激发测控系统。系统根据荧光染料的激发光谱特性,选择大功率窄带LED作为荧光激发光源,并通过STM32微处理器系统进行控制。该荧光激发系统有FAM、HEX和ROX三... 为了解决高通量数字聚合酶链式反应(dPCR)基因芯片荧光激发问题,设计了一套荧光激发测控系统。系统根据荧光染料的激发光谱特性,选择大功率窄带LED作为荧光激发光源,并通过STM32微处理器系统进行控制。该荧光激发系统有FAM、HEX和ROX三个荧光激发通道,各通道LED激发功率能够分别调节。系统最大输出电流为8 A,单通道最大输出功率为3 W,调节精确度<1.0%,系统一次可完成dPCR基因芯片9 600个微液滴的荧光激发和采集。测试实验结果表明,系统达到了设计指标和应用需求。 展开更多
关键词 数字聚合酶链式反应(dpcr) LED光源 荧光激发 测控系统
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