Identification and dipeptidyl peptidase Ⅳ(DPP-Ⅳ) inhibitory activity verification of peptides from mouse lymphocytes

The objective of this study was to isolate and identify the intracellular bioactive peptides from mouse lymphocytes before and after lipopolysaccharide(LPS)stimulation,to explore novel peptides and to research the bioactive function.Mouse spleen lymphocytes were isolated and cultured with LPS stimulation(experimental group)or not(control group)to collect intracellular peptides.Totally 385 peptides were analyzed by nanoliter liquid phase-Q Exactive quadrupole ultra-high resolution orbitrap mass spectrometer(Nano LC-Q Exactive Plus)and identifi ed by PEAKS X software.After compared with peptides reported,131 novel peptides were discovered,which then were predicted bioactivity by Peptide Ranker and 6 peptides with high bioactivity were predicted function by BIOPEP-UMW database.Prediction data showed that they may have dipeptidyl peptidase IV(DPP-IV)inhibitory activity.Finally,two peptides showed better potent inhibition were verifi ed with competitive and noncompetitive modes.

酪蛋白体外消化过程中DPP-IV抑制活性的变化规律及其机制分析

近年来二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽已成为辅助治疗糖尿病的重要手段。本实验以牛乳酪蛋白为研究对象,采用体外胃肠消化模型水解,研究酪蛋白在消化过程中的消化特性和DPP-Ⅳ抑制活性变化情况,并采用液相色谱串联质谱法分析消化过程中DPP-Ⅳ抑制肽典型特征结构序列变化规律,旨在寻找酪蛋白在消化过程中DPP-Ⅳ抑制活性变化机制与典型结构肽变化之间的关系。结果显示:消化特性上,酪蛋白在消化过程中水解度及消化率均随消化时间延长而增加,而其消化产物的DPP-Ⅳ抑制率与未消化产物相比总体上也处于增加趋势,并于240 min时达到最高值58.04%,为120 min胃消化产物的2倍左右(23.22%),水解度及蛋白消化率与DPP-Ⅳ抑制活性之间可能存在某种关联。进一步基于液相色谱串联质谱法分析酪蛋白消化产物中具有DPP-Ⅳ抑制肽典型特征结构(Xaa-Pro/Ala-及Trp-Xaa-,以下均简称特征肽)肽段,胃蛋白酶消化产物中共鉴定出25条特征肽,分子质量主要集中在大于5 kDa,而胰酶消化组分共鉴定出48条特征肽,分子质量集中在小于1 kDa,结合热图结果,发现特征肽段数目及含量均随消化时间呈现增加趋势,与DPP-Ⅳ抑制活性变化规律类似,揭示了酪蛋白消化过程中DPP-Ⅳ抑制活性变化机制与Xaa-Pro/Ala-及Trp-Xaa-肽数目及含量紧密相关。

驼乳乳铁蛋白DPP-IV抑制肽的筛选验证及其防治糖尿病潜在作用机制探究

目的:结合生物信息学,从驼乳乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)中筛选DPP-IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)抑制肽,并利用网络药理学探讨筛选肽段对糖尿病的潜在作用机制。方法:利用BIOPEP网站模拟酶切LF序列产生多条肽段,结合多肽数据库及分子对接筛选潜在的DPP-IV抑制肽,选择其中四条进行人工合成,验证其DPP-IV抑制活性,通过分子对接分析肽段与DPP-IV分子间相互作用方式,Lineweaver-Burk方法分析肽段抑制模式。选择抑制作用较强的GPQY进行网络药理学分析,预测其对糖尿病的潜在作用机制。采用Swiss Target Prediction和GeneCards数据库挖掘GPQY及糖尿病的作用靶点,String数据库获取蛋白与蛋白互作关系,Cytoscape 3.9.0软件构建PPI网络,DAVID数据库对靶点进行GO与KEGG通路富集分析。结果:筛选验证获得2条DPP-IV抑制GPQY和EACAF,其半抑制浓度(IC50)值分别为348.27±16.11和1024.89±19.67μmol/L,抑制模式分析表明GPQY为竞争性抑制,EACAF为混合型抑制。分子对接结果显示两条肽段通过氢键、疏水作用和静电作用与DPP-IV结合。由PPI网络筛选到GPQY有STAT3、MMP9、SRC、MAPK1等25个核心作用靶点,KEGG通路富集显示GPQY防治糖尿病通路涉及IL-17信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、肾素-血管紧张素系统、细胞凋亡等。结论:驼乳LF是DPP-IV抑制肽的良好来源,由其获得的四肽GPQY可通过多靶点、多通路参与炎症反应,影响细胞增殖分化等多方面防治糖尿病及其并发症。

珍珠蚌肉二肽基肽酶-IV抑制肽的制备与分离

目的:以珍珠蚌肉为原料制备对二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase,DPP)-IV具有抑制作用的生物活性肽。方法:利用两步酶解法并优化珍珠蚌肉酶解条件,筛选体外DPP-IV抑制活性较高组分进行超滤膜浓缩,Superdex^(TM) peptide 10/300 GL凝胶柱层析与反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)技术分离纯化出酶解液中的DPP-IV抑制肽,最终通过液相色谱-串联质谱鉴定其氨基酸序列。结果:中性蛋白酶与碱性蛋白酶对珍珠蚌肉均有良好降解效果,经3 kDa超滤膜浓缩后,酶解产物的DPP-IV抑制率可达67.4%。通过凝胶过滤柱和RP-HPLC进一步分离纯化出6个活性较高的肽段,序列分别为FNAPAM、FIPNY、IYNPPTPF、LAMPYP、FFVVMP和LAGMP。进一步,以分子对接的方式分析6个肽段与DPP-IV的相互作用关系。结论:本研究利用珍珠蚌肉制备DPP-IV抑制肽,可为以水产加工副产物为原料制备功能性食品提供理论参考。

胰高糖素样肽-1及其类似物和二肽酰肽酶-IV抑制剂对胰岛功能的保护作用

胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病发病的中心环节。随着病程的进展,多种机制参与导致β细胞功能进行性下降。胰高糖素样肽-1(GLP-1)是由肠道内分泌细胞L细胞分泌的肠促胰岛素,可以葡萄糖依赖性地增加胰岛素分泌、促进胰岛β细胞再生并抑制胰高糖素分泌。长效GLP-1类似物和二肽酰肽酶(DPP)-IV抑制剂能够减少内源性GLP-1在体内降解,从而更有效地保护胰岛β细胞功能,对于糖尿病的防治具有重要意义。

鲟鱼皮中二肽基肽酶-IV抑制肽的分离纯化与鉴定

为从鲟鱼皮中分离提取出二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)抑制活性肽,以鲟鱼皮胶原蛋白为主要材料,利用蛋白酶进行酶解,以DPP-IV抑制率为主要考察指标,在单因素试验的基础上,进一步利用响应面法优化了鲟鱼鱼皮中DPP-IV抑制肽的制备工艺条件,确定最佳酶解条件为:酶解温度50℃、料液比1∶100(g/mL)、pH 6.12、加酶量10170.35 U/g、酶解时间12.12 h。在此基础上,通过超滤、凝胶层析及反相高效液相色谱的方法对酶解产物进行分离纯化;采用液相色谱-串联质谱法对多肽进行鉴定,结果显示纯化后具有DPP-IV抑制活性肽氨基酸组成为:甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-赖氨酸(GPSGLDGAK),IC_(50)值可达(61.27±1.16)μmol/L。本研究结果可为利用鲟鱼皮生产新型的生物活性成分提供参考。

胃旁路术与二肽基肽酶-IV抑制剂治疗对2型糖尿病患者血糖及肠促胰素水平的影响

目的:观察胃肠旁路术与应用二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂治疗后的2型糖尿病患者糖脂代谢变化及肠-胰岛轴激素分泌,进一步了解术后代谢改变机制。方法:符合入选条件的75例2型糖尿病患者随机分两组:胃肠旁路术组(n=42)与DPP-IV抑制剂治疗组(n=33)。观察并比较治疗后各项代谢指标的改变。结果:两组血糖均有明显下降。胃肠旁路术组患者血糖、血脂、体质量较治疗前均显著下降;DPP-IV抑制剂治疗组体质量、血脂下降较治疗前差异无统计学意义。胃肠旁路术组饮食刺激后胰升糖素样肽-1(GLP-1)水平增加。结论:术后肠促胰素水平的增加可能对糖尿病患者血糖、血脂水平的下降起关键作用。手术治疗明显优于DPP-IV抑制剂治疗。

乳清蛋白酶解制备的生物活性肽的研究进展

乳清蛋白中含有抗氧化肽、血管紧张素转换酶(angiote nsin converting enzyme,ACE)抑制肽、二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)抑制肽等多种生物活性肽(bioactive peptides,BAPs),具降血压、降血糖、降血脂等多种功能,有助于人类神经、胃肠、心血管和免疫系统发育,应用前景广阔。BAPs主要由酪蛋白和乳清蛋白经酶促水解、微生物发酵或化学试剂获取。鉴于此,本文概述乳清蛋白的组成及功能,并对国内外有关乳清蛋白酶解制备的BAPs的研究进展进行重点论述,以期为乳清蛋白的高效利用以及相关功能性乳制品的开发提供参考。

食源二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的研究进展

糖尿病是世界上最严重的代谢类疾病之一,二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)抑制剂是一种有效治疗II型糖尿病的药物。食源肽是DPP-IV抑制剂的潜在来源,可能有辅助控制血糖水平的作用。本文对食源DPP-IV抑制肽的获得方式、常规研究路线、结构特征和抑制机制进行了综述,并探讨了生物信息学方法(即肽剪切、分子对接、定量构效关系)在DPP-IV抑制肽研究中的应用及其局限性。本文也对食源DPP-IV抑制肽用作功能性食品配料以辅助调节血糖所需要的进一步研究进行了展望。

二肽基肽酶-Ⅳ抑制剂对自发性2型糖尿病大鼠血清GLP-1和GIP的影响及调控机制

目的观察二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制剂沙格列汀对自发性2型糖尿病(T2DM)大鼠血清肠促胰素胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)的影响,并探讨其调控机制。方法选取40只OLETF大鼠,随机分为4组:自发性T2DM组,低、中、高剂量组,另选取同种系10只LETO大鼠为对照组。3剂量组给予浓度分别为(0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2 mg/ml)沙格列汀灌胃,自发性T2DM组和对照组给予生理盐水灌胃,1次/d,持续12周。对比灌胃6、12周后各组血清胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)水平;灌胃12周后进行糖耐量试验,并对比各组空腹胰岛素(FINS)水平;灌胃12周后处死取胰脏组织检测并对比胰腺细胞凋亡率、蛋白激酶B(Akt)、叉头转录因子1(FoxO1)、胰十二指肠同源盒因子(Pdx1)、葡萄糖转运子1(GLUT2)、葡萄糖激酶(GCK)mRNA、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)蛋白相对表达量。结果血清GLP-1、GIP、FINS水平、p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1值、Pdx1、GLUT2、GCK mRNA和蛋白组间比较,对照组最高、中剂量组其次、低、高剂量组稍低、自发性T2DM组最低,除低、中剂量组比较差异无显著性外(P>0.05),其他每2组间比较差异均有显著性(P<0.05);灌胃第12周血清GLP-1、GIP水平与灌胃第6周比较,3剂量组显著升高(P<0.05),自发性T2DM组显著降低(P<0.05),对照组差异无显著性(P>0.05);自发性T2DM组大鼠在注射葡萄糖后60 min血糖水平达到峰值;对照组及3剂量组在注射后30 min血糖水平达到峰值,且在30~120 min内随时间延长显著降低(P<0.05);糖耐量试验血糖水平、胰腺细胞凋亡率组间比较,对照组最低、中剂量组其次、低、高剂量组稍高,自发性T2DM组最高,除低、中剂量组比较差异无显著性外(P>0.05),其他每2组间比较差异均有显著性(P<0.05)。结论 DPP-4抑制剂可显著促进自发性T2DM大鼠GLP-1、GIP的分泌,调节糖代谢,减少胰岛细胞凋亡,其中1 mg/kg DPP-4抑制剂效果最佳,推测与上调p-Akt、p-FoxO1蛋白、Pdx1、GLUT2、GCK mRNA和蛋白表达、激活FoxO1/Pdx1信号通路有关。

胰岛β细胞功能衰竭在2型糖尿病发病机理中的作用及降糖药物的选择

2型糖尿病患者中,胰岛β细胞功能与细胞数量及质量均呈进行性减低。胰岛β细胞数量的减少与其细胞凋亡加速有关。影响胰岛β细胞功能进行性减低的因素包括葡萄糖毒性作用、脂毒性作用、促炎症细胞因子与瘦素以及胰淀粉样蛋白沉积。胰岛素、噻唑烷二酮、胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物及二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂可减慢β细胞功能衰竭的速度和程度。

乳清蛋白及其生物活性肽调节血糖功能研究进展

乳清蛋白及其生物活性肽具备多种保健功能,其调节血糖的功效受到关注,且乳清蛋白已被证实具有延缓2型糖尿病的功效。糖尿病是当今全球十大致死疾病之一,而90%的糖尿病患者所患为2型糖尿病。生活方式干预和药物营养治疗是当下治疗糖尿病的重要手段。前人的研究表明乳清蛋白及其生物活性肽调节血糖机理包括改善胰岛素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶活性、促进肠促胰素分泌等。本文综述了乳清蛋白及其生物活性肽调节血糖的作用及其调节血糖可能机制的研究进展,归纳了乳清蛋白源二肽基肽酶-IV抑制肽的相关研究,以期为乳品行业革新提供参考。

紫贻贝(Mytilus edulis)蛋白计算机模拟消化物活性的生物信息学分析

贻贝(Mytilus sp.)是我国常见的养殖贝类之一,具有很高的食用价值。然而,我国目前贻贝产品仍以活鲜品为主,产品单一,资源利用不足。对紫贻贝(Mytilus edulis)蛋白进行模拟消化获得寡肽(二肽至五肽),通过PeptideRanker活性评分以及理化性质分析,从这些寡肽中筛选出9条具有潜在研究价值的多肽。通过ADMET分析和BIOPEP-UWM生物活性预测,发现其中7条寡肽具有血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性,7条寡肽具有二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)抑制活性。通过SwissDock和iDPPIV-SCM进一步筛选,确定QYGGR和HMR分别具有最优的ACE和DPP-IV抑制活性。通过分子对接发现,QYGGR和ACE以及HMR和DPP-IV能够形成稳定的复合物,其CDOCKER能值分别为-156.078和-92.410 kcal/mol,其中QYGGR通过与ACE分子中的8个氨基酸残基发生相互作用而产生抑制。HMR通过与DPP-IV S1中的5个,S2中的3个以及S3中的1个氨基酸残基发生相互作用而产生抑制。该研究结果为紫贻贝营养价值的阐释以及紫贻贝来源的生物活性肽的开发提供了理论依据。

马氏珍珠贝来源DPP-Ⅳ抑制活性肽的虚拟筛选及其作用机制

为了快速发现马氏珍珠贝来源二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制活性肽,本研究利用数据库中20个已报道的DPP-Ⅳ抑制肽组成训练集,构建了药效团模型并通过测试集分子和Fisher随机验证法对模型进行了评估。利用在线网站PeptideCutter,以珍珠贝肉蛋白为原料,进行虚拟酶解。使用最优药效团模型(Hypo1)对虚拟酶解获得的192个低分子肽(氨基酸数小于或等于5)进行初步筛选,接着以分子对接的方法进一步筛选,并且对潜在的DPP-Ⅳ抑制活性肽进行固相合成,体外验证其活性并分析其作用机制。结果表明,药效团结合分子对接技术筛选了4个理论上可能具有高活性的DPP-Ⅳ抑制肽,即LPIY、VQDR、PIY和APSL。其中,VQDR、PIY没有表现出抑制活性,而LPIY和APSL具有较高的DPP-Ⅳ抑制活性,其IC50值分别为521.19和258.67μmol/L。与DPP-Ⅳ相互作用的机理表明,肽LPIY和APSL与DPP-Ⅳ活性口袋中的氨基酸残基形成了多个氢键,且N-端第二个位置的脯氨酸(P)也均与活性口袋中的残基形成了Pi-Alkyl作用,因此促进了LPIY和APSL的DPP-Ⅳ抑制作用。本研究为高效筛选珍珠贝来源的DPP-Ⅳ抑制肽提供了理论方法。

酶解豆类蛋白制备活性肽研究进展

豆类蛋白源活性肽具有抗氧化、血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制、二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制和抗炎等活性,在防治高血压和糖尿病等慢性疾病中起积极作用,对维护人体健康具有重要意义。该文就目前国内外豆类蛋白源活性肽的酶法制备及其活性予以综述,并对其发展趋势进行展望,旨在为健康功能性食品的研究与开发提供参考。

大米谷蛋白模拟酶解释放生物活性肽的研究

目的通过对大米谷蛋白的模拟酶解及生物信息学分析,评价大米谷蛋白作为生物活性肽前体的潜在价值。方法首先,利用计算机在UniProt蛋白质数据库中查找大米谷蛋白的序列,使用BIOPEP活性肽数据库对所选的3条序列进行模拟酶解,并同时对酶解产生的肽片段数量、分子量及其氨基酸组成进行统计分析。然后,将模拟酶解产生的肽片段序列与BIOPEP数据库中已有记载的生物活性肽序列进行对比,筛选出具有生物活性的肽片段。最后,对模拟酶解产生的生物活性肽进行致敏性和毒性预测。结果胃蛋白酶和木瓜蛋白酶是最适合水解大米谷蛋白的两种酶。大米谷蛋白酶解可产生许多生物活性肽,其中出现频率最高的是二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽和血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制肽。大米谷蛋白本身无潜在致敏性,且其经过计算机模拟酶解得到的DPP-Ⅳ抑制肽和ACE抑制肽均无细胞毒性。结论大米谷蛋白可作为酶解释放DPP-Ⅳ抑制肽和ACE抑制肽的良好前体,本研究为大米谷蛋白酶解生产生物活性肽提供了理论指导。

二肽基肽酶-Ⅳ抑制活性酵母筛选与鉴别

二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制剂是一类二型糖尿病治疗药物,可通过延缓肠泌素的降解达到控制血糖的效果。该研究对分离自酒醅的酵母菌进行筛选,得到2株具有DPP-Ⅳ抑制活性的酵母菌,命名为菌株J6和J8。通过生理生化反应试验和26S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,这两株酵母菌中,J6为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),J8为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

具有DPP-Ⅳ抑制活性的酪蛋白糖肽分离纯化及其序列鉴定

采用牛乳酪蛋白糖巨肽制备酪蛋白糖肽,并分析其对二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ, DPP-Ⅳ)活性的抑制作用,筛选DPP-Ⅳ抑制活性最强的酪蛋白糖肽,并进行分离鉴定。结果表明:(1)酪蛋白糖肽的DPP-Ⅳ抑制率最高达54.55±3.65%;(2)经葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)分离得到两个组分,其中F1组分具有较强的DPP-Ⅳ抑制活性,抑制率达63.27±3.24%;(3)进一步利用反相高效液相色谱及液相色谱串联质谱从F1组分中分离并鉴定得到3条DPP-Ⅳ抑制肽,肽序列分别为MAIPPKKNQDKT、PPKKNQDKTEIPTI、SPEVIESPPEIN。研究结果表明酪蛋白糖巨肽经酶解获得的酪蛋白糖肽具有DPP-Ⅳ抑制活性,具备作为降糖活性功能性配料开发的潜在性。

肠促胰岛素类药物的安全性评估

肠促胰岛素类药物包括GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂。由于本类药物不同于其他传统降糖药物的独特作用机制,近年来的研究及临床应用取得了飞速进展。但是,人体内多脏器表达GLP-1受体、DPP4的底物众多,长期应用肠促胰岛素类药物的安全风险尚存在不确定性。故本文分别从胰腺、甲状腺、心血管系统、消化系统等方面,对本类药物近期的安全性研究进行了综述和分析。结果提示本类药物治疗引发胰腺炎和肿瘤的潜在风险是目前临床最大的担忧,有必要对肠促胰岛素类药物的临床应用进行长期的监测,为临床应用的安全性提供可靠数据。

利用牡蛎制备DPP-Ⅳ抑制肽及其活性分析

以牡蛎肉为原料制备二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ,EC 3.4.14.5)抑制肽。通过对比5种蛋白酶(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶)制备的酶解液对DPP-Ⅳ的抑制活性,发现胰酶制备的酶解液对DPP-Ⅳ抑制效果最好。通过优化胰酶酶解条件,确定最优酶解条件为加酶量0.8%、pH 8.0、温度37℃,酶解时间90 min。酶解液经超滤、Sephadex G-15和高效液相色谱分离纯化,获得肽片段。通过质谱鉴定筛选得到2种肽段的序列为Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys(EITALAPSTMK)和Ile-LeuAla-Pro-Pro-Glu-Arg(ILAPPER)。利用BIOPEP在线模拟分析了这2个肽的胃肠液消化特性。采用固相合成法合成肽段APSTM和ILAPPER,并应用于DPP-Ⅳ抑制活性研究。结果显示,2个肽段的IC50值分别为354.81 μmol/L和16.98 μmol/L。分子对接结果表明,抑制肽与DPP-Ⅳ的活性部位主要以氢键、范德华力和π键相互作用为主。本研究通过酶解牡蛎肉制备高抑制活性的DPP-Ⅳ抑制肽,为以牡蛎为原料的功能性食品开发利用提供了理论基础。