高纯度白喉毒素突变体CRM197的制备及鉴定

为了制备高纯度的白喉毒素无毒突变体CRM197,可作为载体蛋白用于细菌性结合疫苗开发,对CRM197基因进行大肠杆菌密码子优化,并克隆至表达载体pET28a(+)中,将鉴定正确的重组质粒pET28a-CRM197转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并分析其表达形式及表达条件的优化。再对表达的重组CRM197蛋白进行纯化,最后对纯化的CRM197进行WB、纯度、分子量和圆二色谱等检测项目的初步鉴定分析。PCR酶切和测序鉴定结果表明重组质粒pET28a-CRM197构建成功,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组工程菌(E.coli(DE3/p28a/197))。该重组工程菌发酵的最佳接种量为5%~10%(v/v),且主要以包涵体形式表达,收获的菌体在高压均质机破碎压力为1000 bar的条件下进行破碎,然后利用6 mol/L盐酸胍进行溶解变性,复性及经30 kD超滤膜包超滤后上纯化系统AKTA pure150 M,经一步阴离子交换层析进行纯化,其纯度可达98%以上,WB、分子量及圆二色谱等鉴定结果均与标准品一致。综上所述,成功建立大肠菌表达系统CRM197制备方法,具有无标签、产量高及纯度高等特点,可用于该蛋白的规模化生产。