产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重PCR检测方法的建立

为建立快速特异的PCR方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌,本研究根据GenBank登录的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和toxA毒素基因序列,设计合成了2对特异引物。特异性试验表明产毒素多杀性巴氏杆菌C51-6扩增出了460bp和1854bp的2条目的片段,而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性;敏感性试验表明该PCR方法能从含450CFU的菌液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验对该PCR方法进行了验证。

PRRSV和PCV-2双重PCR检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和猪圆环病毒2型(PCV-2)(AF381175)的ORF2基因保守序列,设计合成了两对特异性引物。用这两对引物,通过优化的PCR条件,对PRRSV阳性毒株反转录后的cDNA模板和PCV-2毒株的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到两条与试验设计相符的432bp(PRRSV)和630bp(PCV-2)特异性条带,建立了同时检测PRRSV和PCV-2的双重PCR方法。并用此方法对在安徽省不同地区所采集的72头份病猪的淋巴结、肺、肝、脾、肾等组织进行检测,证明建立的PCR方法可用于临床诊断。

双重套式PCR对不同取样胚胎性别鉴定灵敏度测试

目的 :测定双重套式PCR微量扩增体系的灵敏度 ,为附植前遗传学诊断 (PGD)、家畜胚胎性别鉴定等提供技术保障。方法 :以桑椹胚卵裂球为模板进行扩增 ,建立昆明白小鼠特异的SRY ZFX双重套式PCR性别鉴定体系。按卵裂球数量的不同分为五组 ,对应的卵裂球个数分别为 1、2、3、4、5及以上。根据有效扩增结果得出双重套式PCR的灵敏度。结果 :第 1组 (卵裂球个数为 1 ) ,有效检出率为 85 % ( 34 /40 ) ,污染率为 7 5 % ( 3 /40 ) ,漏检率为 7 .5 % ( 3 /40 )。随着卵裂球个数的增多 ,有效检出率逐渐升高 ,而污染率和漏检率则呈逐渐下降趋势。第 5组 (卵裂球达到 5及以上 ) ,有效检出率达到 1 0 0 % ,漏检率为 0。对于第 2、3、4、5组而言 ,有效检出率及漏检率各组间并无显著差异 (P >0 . 0 5 ) ;而第一组与其它各组间 ,有效检出率及漏检率存在显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :双重套式PCR可以有效扩增基因组DNA量约为 1 2pg的模板 ,且扩增片段为单拷贝片段。

猪细小病毒和猪源脑心肌炎病毒的二重PCR检测方法的建立

试验旨在建立能同时检测猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和猪源脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EM-CV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中PPV VP2基因和EMCV 3D基因序列,利用Premier 5.0软件设计出PPV和EMCV的特异性引物。通过优化反应条件,建立了能同时特异性检测PPV和EMCV的二重PCR方法,PPV和EMCV的敏感性检测极限分别达7.62和1.22×10-1pg/μL。通过对临床36份样品的检测结果表明,该二重PCR检测方法敏感、特异,适合于临床检测应用。

双重RT-PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸方法建立

目的:建立快速且简便的常见腹泻病毒筛检和诊断方法,为及时明确病因、控制病原体的传播以及采取有效的治疗措施,防止抗生素滥用提供病原学依据。方法:对建立的一步法双重RT-PCR进行灵敏度、特异性、重复性分析。并应用该方法对28份疑似病毒性腹泻监测标本进行轮状病毒和诺瓦克病毒核酸检测,同时用普通RT-PCR方法、乳胶凝集法和基因序列分析进行检测结果验证。结果:检测出轮状病毒核酸6份,诺瓦克病毒核酸2份,验证符合率达100%。结论:一步法双重RT-PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸的方法建立,不仅节省了检测过程中的人力、试剂和时间,更重要的是提高了应急筛检的能力,为病毒性腹泻病及时防控和治疗赢得时间。

应用二重PCR技术检测肉制品中的肉源性成分

在建立单重PCR的基础上成功建立了多种二重PCR体系,以同时检测2种肉源成分(猪、牛、鸡和羊)。PCR扩增的是每种动物的线粒体基因,由于鸡、羊的PCR扩增片段大小过于接近(131和119 bp),电泳图上不易区分,故试验中的二重PCR体系使用了5种动物组合。所建立的二重PCR方法能够迅速、稳定地同时鉴别2种肉源性成分,为下一步建立三重或四重PCR方法奠定了良好的基础。

牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测方法的建立

为建立牛新孢子虫的快速准确检测方法,根据犬新孢子虫种属特异性基因Nc-5序列,设计高度保守的引物和荧光探针,通过引物设计和搭桥PCR法扩增,获得Nc-5荧光PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测体系。该方法具有较好的特异性;可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当;通过对系列稀释的核酸样品的重复性检测,变异系数为0.50%～1.30%。通过对58份临床样品分别用该方法、不含内标的荧光PCR方法和普通PCR方法检测,结果显示,该方法与不含内标的荧光PCR方法的阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率(7.0%)高;表明该方法可用于临床样品中牛新孢子虫的快速检测,并能对实验室进行质量控制。