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蓝细菌分离DnaE内含肽的自我剪接研究 被引量:2
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作者 魏新元 丑敏霞 +1 位作者 闻盼盼 刘东斌 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2009年第2期160-164,共5页
【目的】证实蓝细菌Anabaenasp.PCC 7120复制酶中分离的DnaE内含肽的自我剪接活性。【方法】分别将AnabaenaPCC 7120中分离的2个dnaE基因的部分序列克隆到表达载体上,获得重组表达质粒,经超量表达和纯化后,免疫家兔获得相应的抗体;同时... 【目的】证实蓝细菌Anabaenasp.PCC 7120复制酶中分离的DnaE内含肽的自我剪接活性。【方法】分别将AnabaenaPCC 7120中分离的2个dnaE基因的部分序列克隆到表达载体上,获得重组表达质粒,经超量表达和纯化后,免疫家兔获得相应的抗体;同时,两段分离的dnaE序列被克隆到同一表达载体,构建双重组表达质粒,两段序列具有各自的ORF,但由同一启动子调控。双重组表达质粒经诱导之后,利用以上获得的抗体对含有内含肽的DnaE蛋白在大肠杆菌表达体系中的自我剪接反应进行检测。【结果】在双重组表达质粒的表达产物中,抗体不仅可以分别与对应的蛋白质反应,而且还可以同时识别1条新条带,该条带的表观分子量与成熟DnaE的理论值大致相符。【结论】蓝细菌分离的DnaE内含肽在大肠杆菌表达体系中可以进行自我剪接;本研究中获得的抗体具有较好的特异性,无明显背景干扰,而且效价高,抗体可以稀释1 000倍以上使用,也可以用于相关方面的研究。 展开更多
关键词 dnae内含肽 重组表达质粒 自我剪接 蓝细菌
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含有分裂型内含肽DnaE基因的表达盒设计、合成及高效表达载体的构建 被引量:1
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作者 赵珺 王洋 +4 位作者 师明磊 王东 田靖 耿排力 赵志虎 《生物技术通讯》 CAS 2010年第6期751-756,共6页
目的:建立一种简便、快捷的基因从头设计、优化与合成策略,进行含有分裂型内含肽DnaE基因的表达盒全合成并构建高效表达载体。方法:以免费软件GeneDesign 3.0为主要平台,同时结合Tandem Repeats Finder、UNAFold等不同生物信息学软件,... 目的:建立一种简便、快捷的基因从头设计、优化与合成策略,进行含有分裂型内含肽DnaE基因的表达盒全合成并构建高效表达载体。方法:以免费软件GeneDesign 3.0为主要平台,同时结合Tandem Repeats Finder、UNAFold等不同生物信息学软件,对含有DnaE基因、合适酶切位点的表达盒进行设计与分段合成;合成寡核苷酸片段通过重叠PCR进行组装与克隆。结果:利用建立的设计流程,合成了大小为44~64 nt的14段寡核苷酸片段,通过重叠PCR,实现了14段寡核苷酸片段的一次性组装,经过克隆、酶切鉴定、序列分析得到了序列完全正确的表达载体。结论:建立了一套有效的、基于免费软件的基因从头设计与合成的策略,构建了可以用于环肽小分子文库表达与筛选的表达载体。 展开更多
关键词 内含肽dnae 基因设计与合成 生物信息学
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Npu DnaE内含肽构建及其对293T细胞高效反式剪接活性分析
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作者 张矫 崔文静 +2 位作者 马祥敏 王雯雯 王欣 《山东医药》 CAS 2013年第44期10-13,I0002,共5页
目的构建Npu DnaE内含肽,探讨Npu DnaE内含肽是否在293T细胞中具备高效反式剪接活性。方法制备融合基因Vn-NDn-myc和NDc-Vc,插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体,构建质粒。转染293T细胞,荧光显微镜下观察目的蛋白Venus是否形成。48 h后收集... 目的构建Npu DnaE内含肽,探讨Npu DnaE内含肽是否在293T细胞中具备高效反式剪接活性。方法制备融合基因Vn-NDn-myc和NDc-Vc,插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体,构建质粒。转染293T细胞,荧光显微镜下观察目的蛋白Venus是否形成。48 h后收集细胞蛋白,应用Western blot技术进一步印证。结果构建的质粒经限制性内切酶鉴定及测序比对正确,转染293T后可见共转染细胞组出现明亮荧光,弥漫分布于细胞质中,Western blot证明高量目的蛋白Venus形成。结论成功构建Npu DnaE内含肽,其能在293T细胞中发挥反式剪接的生物学功能,并具有高效的剪接效率及功能目的蛋白形成率。 展开更多
关键词 NPU dnae 内含肽 蛋白质反式剪接
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蓝细菌断裂DNA聚合酶DnaE的体内/外反式剪接分析
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作者 魏新元 闻盼盼 丑敏霞 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期448-454,共7页
蓝细菌Anabaena PCC7120的DNA聚合酶DnaE由2个断裂基因dnaENI和dnaECI编码.通过纯化它们的部分基因在大肠杆菌中的表达产物DnaENI′和DnaECI′来免疫家兔获得抗体,用于对断裂的DnaE在体内和体外的反式剪接活性进行鉴定.在体外实验中,将... 蓝细菌Anabaena PCC7120的DNA聚合酶DnaE由2个断裂基因dnaENI和dnaECI编码.通过纯化它们的部分基因在大肠杆菌中的表达产物DnaENI′和DnaECI′来免疫家兔获得抗体,用于对断裂的DnaE在体内和体外的反式剪接活性进行鉴定.在体外实验中,将2个断裂的DNA聚合酶DnaENI′和DnaECI′混合,进行反应,并利用它们的抗体对反应产物进行鉴定;在体内实验中,利用以上抗体对Anabaena PCC7120细胞总蛋白进行免疫杂交分析.实验结果表明,蓝细菌AnabaenaPCC7120中断裂的2个DnaE多肽在体内和体外均能进行反式剪接.体外实验中,纯化的DnaENI′和DnaECI′的混合反应产生新的蛋白产物,既有成熟的反式剪接产物DnaEN′-,又有剪切了内含肽后的副产物DnaEN′和DnaE,且DTT的存在对剪接反应具有促进作用;此外体内实验中,在Anabaena PCC7120细胞中既能检测到完整的DnaE,也能检测到未作用的DnaENI,但未能检测到DnaECI. 展开更多
关键词 DNA聚合酶dnae ANABAENA PCC 7120 内含肽 反式剪接
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采用PCR法检测乙肝及HBsAg携带者DNAe系统结果分析
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作者 齐佳华 黄佳莉 《佳木斯医学院学报》 1998年第1期77-78,共2页
关键词 聚合酶链反应 HBSAG dnae系统 检测
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大肠杆菌BL21(DE3)中DnaE intein介导ABCA1蛋白的连接
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作者 朱甫祥 缪静 +1 位作者 屈慧鸽 迟晓艳 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1601-1606,共6页
【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的12... 【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的123个氨基酸的N端和36个氨基酸的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)。转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,诱导表达后观察重组蛋白的表达和ABCA1的连接。【结果】转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示预期大小的ABCA1剪接蛋白条带,并进一步为His-Tag抗体进行的Western blotting证实。【结论】结果表明SspDnaEintein可有效催化ABCA1的连接,为进一步研究利用双腺相关病毒(AAV)载体转运ABCA1基因,克服单个AAV载体容量限制进行由ABCA1基因突变所致Tangier病的基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 dnae INTEIN 蛋白质反式剪接 ABCA1 连接
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断裂型内含肽Npu DnaE的C端序列赖氨酸突变对其剪接活性的影响
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作者 张敬仪 朱建伟 张宝红 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1719-1725,共7页
断裂型内含肽Nostoc punctiforme(Npu)DnaE作为一种为构建抗体-药物偶联物(ADC)过程中实现定点偶联的工具,其C端序列中的赖氨酸对其剪接活性有较大影响。该研究对断裂型内含肽Npu DnaE C端序列中的赖氨酸进行定点突变,得到了5种氨基酸(... 断裂型内含肽Nostoc punctiforme(Npu)DnaE作为一种为构建抗体-药物偶联物(ADC)过程中实现定点偶联的工具,其C端序列中的赖氨酸对其剪接活性有较大影响。该研究对断裂型内含肽Npu DnaE C端序列中的赖氨酸进行定点突变,得到了5种氨基酸(精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸)取代的多肽序列,以探究不同氨基酸取代对其剪接活性的影响。结果显示分别由精氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸3种氨基酸取代赖氨酸的内含肽C端序列保持了剪接活性,其中精氨酸取代的内含肽C端序列剪接效率较高。采用精氨酸取代的内含肽C端序列制备了ADC HER2-Lc-SMCCDM1,经检测其保有抗原亲和力和抗肿瘤活性。该研究结果为ADC的定点偶联和基于内含肽设计、改造蛋白质或多肽连接合成相关研究提供了技术支撑。 展开更多
关键词 Npu dnae 断裂型内含肽 赖氨酸突变 剪接活性 抗体-药物偶联物
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断裂内含肽C片段在大肠埃希菌表达系统中酶解稳定性的改良
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作者 陈浩 曹津 +2 位作者 张静 朱建伟 陈俊升 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期340-348,共9页
断裂内含肽Npu DnaE介导的蛋白质剪接、剪切反应,可以应用于蛋白质工程领域诸多方面,但其C段重组蛋白在表达纯化过程中发生的降解,降低了重组蛋白的产率和纯度。为提高NpuC段稳定性,本研究构建了N端融合NpuN2片段的NpuC延长变体N2C。将... 断裂内含肽Npu DnaE介导的蛋白质剪接、剪切反应,可以应用于蛋白质工程领域诸多方面,但其C段重组蛋白在表达纯化过程中发生的降解,降低了重组蛋白的产率和纯度。为提高NpuC段稳定性,本研究构建了N端融合NpuN2片段的NpuC延长变体N2C。将N2C在BL21(DE3)中进行表达、用亲和色谱进行纯化,用ImageJ扫描计算表达纯化中降解情况,进而对影响内含肽C端剪切反应的各因素如温度、DTT浓度、N/C比例等进行了考察。结果表明,延长变体N2C使降解产物占比降低至2.7%~7.2%,在1 mmol/L DTT催化,N/C比例为5∶1,37℃反应条件下,30 min产物生成率达90%。N2C在提升Npu DnaE内含肽C段在大肠埃希菌表达系统中表达、纯化过程的稳定性的同时,保留了其C端剪切反应的活性,对其在蛋白纯化领域应用有重要意义。 展开更多
关键词 Npu dnae C端剪切 蛋白质稳定性 蛋白质降解
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南非科学家日前发现肺结核抗药蛋白
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作者 冯立文 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期371-371,共1页
关键词 南非威特沃特斯兰德大学 肺结核杆菌 抗药性 肺结核抗药蛋白 作用机理 DNA聚合酶 dnae2蛋白
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乙肝病毒DNA与e系统和肝损害程度的关系
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作者 成碧莲 阮昌海 《中国煤炭工业医学杂志》 1999年第4期339-340,共2页
关键词 乙型肝炎病毒 dnae系统 肝损伤
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耻垢分枝杆菌中DNA损伤与SOS反应的实验研究 被引量:2
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作者 吴雯 梅建 +2 位作者 沈鑫 张曦 陈敏 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2014年第10期880-884,940,共6页
目的探讨基因毒性物质介导的DNA损伤引起分枝杆菌SOS反应的作用。方法选择耻垢分枝杆菌为分枝杆菌模式细菌,通过紫外线损伤试验检测耻垢分枝杆菌对紫外线的敏感性,通过2倍稀释法测定利福平和氧氟沙星的最小抑菌浓度(MIC)。分别用紫外线... 目的探讨基因毒性物质介导的DNA损伤引起分枝杆菌SOS反应的作用。方法选择耻垢分枝杆菌为分枝杆菌模式细菌,通过紫外线损伤试验检测耻垢分枝杆菌对紫外线的敏感性,通过2倍稀释法测定利福平和氧氟沙星的最小抑菌浓度(MIC)。分别用紫外线和次抑菌浓度(1/2MIC)抗生素处理耻垢分枝杆菌,在不同时间点收集菌液,以看家基因sigA为内参,采用实时定量PCR相对定量方法检测dnaE2、recA和recX等SOS基因表达水平的变化。结果紫外线暴露45s后耻垢分枝杆菌的存活率为50%,利福平和氧氟沙星的MIC分别是32μg/ml和1μg/ml。耻垢分枝杆菌dnaE2和recX等SOS基因表达水平在紫外线下暴露45s后即开始上升,recA的表达水平在紫外线暴露3h后显著上升。耻垢分枝杆菌dnaE2和recX基因表达水平在1/2MIC的利福平作用后1h或在1/2MIC的氧氟沙星作用0h后上升,recA的表达水平在1/2MIC的利福平或氧氟沙星作用3h时显著升高。结论紫外线、抗生素等基因毒性物质可以导致耻垢分枝杆菌DNA损伤及SOS基因表达水平上升。 展开更多
关键词 耻垢分枝杆菌 基因损伤 SOS反应 dnae2 RECA recX
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通过断裂内含肽介导的反式剪接合成大的蛋白 被引量:1
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作者 张静 刘环 +1 位作者 周晶 刘建华 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期74-78,共5页
大肠杆菌难以表达大的蛋白,毒性蛋白以及膜蛋白,"Npu DnaE内含肽表达系统"使这些蛋白的表达成为可能。该系统的基本原理是:在特定位点处将目标基因(编码T7 RNA聚合酶的基因)断裂成两部分,然后分别与Npu DnaE内含肽的N端,C端... 大肠杆菌难以表达大的蛋白,毒性蛋白以及膜蛋白,"Npu DnaE内含肽表达系统"使这些蛋白的表达成为可能。该系统的基本原理是:在特定位点处将目标基因(编码T7 RNA聚合酶的基因)断裂成两部分,然后分别与Npu DnaE内含肽的N端,C端片段融合,两种融合基因分别表达纯化,在体外将两种融合蛋白等摩尔比混合即可产生有功能的T7 RNA聚合酶。理论上,该体系也可用于合成其他大的蛋白,毒性蛋白或膜蛋白。 展开更多
关键词 大的蛋白 毒性蛋白 膜蛋白 NPU dnae内含肽 T7 RNA聚合酶
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Split内含肽高效介导转录激活因子的胞内融合 被引量:1
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作者 高元吉 赵传科 +5 位作者 尹琪 王慧 曾新 王少鹏 于文文 栗世铀 《中国科学(C辑)》 CSCD 北大核心 2008年第8期714-721,共8页
Split内含肽可以通过反式剪接作用介导两个蛋白片段的共价连接.基于这一原理,利用来自于Synechocystis sp.strain PCC6803的天然split内含肽DnaEs作为蛋白剪接元件,通过其反式剪接作用介导了四环素阻遏蛋白(TetR)与1-型单纯疱疹病毒(HSV... Split内含肽可以通过反式剪接作用介导两个蛋白片段的共价连接.基于这一原理,利用来自于Synechocystis sp.strain PCC6803的天然split内含肽DnaEs作为蛋白剪接元件,通过其反式剪接作用介导了四环素阻遏蛋白(TetR)与1-型单纯疱疹病毒(HSV)的转录活化域(VP16)的共价连接,形成融合蛋白TV.应用RT-PCR技术以及荧光显微镜成像技术分别在mRNA转录水平与蛋白表达水平上研究了DnaEs的剪接活性,结果证明在细胞内DnaEs可以介导融合蛋白TV的产生.同时也对融合蛋白TV的转录活性进行了研究,并将其与通过重组DNA表达得到的同种蛋白的转录活性进行了比较,发现DnaEs介导的融合蛋白与基因重组得到的同种蛋白转录活性相似.此外,还研究了四环素类似物Dox对TV转录活性的调控,结果表明Dox可以明显抑制其转录活性.DnaEs介导转录激活因子融合,并启动下游报告基因表达的实验方法,为深入开展DnaEs的应用研究提供了重要实验依据. 展开更多
关键词 dnaes 蛋白剪接 四环素阻遏蛋白 1-型单纯疱疹病毒 转录活化域 转录激活因子
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Comparative Analysis of Eubacterial DNA Polymerase III Alpha Subunits
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作者 Xiao-Qian Zhao Jian-Fei Hu and Jun Yu 《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》 SCIE CAS CSCD 2006年第4期203-211,共9页
DNA polymerase Ⅲ is one of the five eubacterial DNA polymerases that is responsible for the replication of DNA duplex. Among the ten subunits of the DNA polymerase Ⅲ core enzyme, the alpha subunit catalyzes the reac... DNA polymerase Ⅲ is one of the five eubacterial DNA polymerases that is responsible for the replication of DNA duplex. Among the ten subunits of the DNA polymerase Ⅲ core enzyme, the alpha subunit catalyzes the reaction for polymerizing both DNA strands. In this study, we extracted genomic sequences of the alpha subunit from 159 sequenced eubacterial genomes, and carried out sequence- based phylogenetic and structural analyses. We found that all eubacterial genomes have one or more alpha subunits, which form either homodimers or heterodimers. Phylogenetic and domain structural analyses as well as copy number variations of the alpha subunit in each bacterium indicate the classification of alpha subunit into four basic groups: polC, dnaE1, dnaE2, and dnaE3. This classification is of essence in genome composition analysis. We also consolidated the naming convention to avoid further confusion in gene annotations. 展开更多
关键词 DNA polymerase III alpha subunit dnae polC
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