利用花粉管通道转化谷子DNAj基因获得转基因小麦

为提高小麦的抗旱能力,采用花粉管通道法将本实验室克隆的谷子抗逆相关基因DNAj转入小麦中。对授粉方式、柱头处理方式、质粒DNA浓度及DNA稀释试剂等因素对结实率的影响进行了对比,结果只有授粉方式对结实率的影响有显著差异,其他条件下结实率均未显示显著差异。对转化获得的703株T0小麦植株提取DNA进行分子检测,有1株小麦稳定扩增到了预期的1 260 bp的目的基因片段。虽然转化效率偏低(1.42‰),但说明利用花粉管通道法将谷子的抗逆相关基因DNAj导入小麦是可行的,为创造抗逆性改良的小麦新材料奠定了基础。

无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD 50为5.68×10 4 CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。

猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较。结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868bp(GenBank登录号为:JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99%,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断。

黄瓜DnaJ基因家族鉴定及对高温胁迫的表达响应

[目的]本文旨在研究黄瓜热激蛋白DnaJ(CsDnaJ)的家族基因鉴定,并分析其在高温胁迫环境下的响应模式。[方法]利用生物信息学软件及黄瓜的全基因组测序数据库、公共数据库对CsDnaJ进行基因家族成员、染色体位置、蛋白特性、结构特征、进化及复制模式和组织表达特性分析,同时通过实时定量PCR技术分析其在高温胁迫环境下的响应模式。[结果]黄瓜CsDnaJ基因家族共存在81个成员基因,其中Chr 3含DnaJ基因最多,为16个,Chr 4、Chr 7最少,均为9个;CsDnaJ基因所编码的蛋白序列长度为113~2551 aa,且至少含有1个完整的J结构域核心区序列;亚细胞位置预测显示大部分蛋白定位于细胞核及叶绿体中。基因结构显示CsDnaJ基因均含有1~22个外显子。通过进化分析发现CsDnaJ蛋白可明显区分为9个亚簇,每个亚簇均存在拟南芥同源蛋白。共线性分析发现,CsDnaJ基因家族共存在17个共线基因,组成10对复制基因对,其中存在5对片段重复事件,3对串联重复事件,2对随机重复事件。组织表达特异性结果显示CsDnaJ基因在叶、茎、子房中的表达量略高于其在雄花、雌花、根及卷须中的表达量。荧光定量PCR结果显示,高温环境(昼/夜温度为42℃/35℃)可以诱导CsDnaJ基因的高表达,从而参与植物响应高温环境胁迫进程。[结论]黄瓜CsDnaJ基因家族核心结构域高度保守,在黄瓜响应高温胁迫中发挥重要作用。

过表达dnaJ基因对鲍曼不动杆菌生物膜形成的影响

目的研究过表达dnaJ基因对鲍曼不动杆菌生物膜形成的影响。方法以ATCC19606基因组DNA为模板扩增dnaJ基因并与质粒pWH1266双酶切后连接,筛选重组质粒并转化菌株ATCC19606,从而构建dnaJ基因过表达菌株19606-p-dnaJ,类似的办法构建空质粒对照组19606-p,用半定量结晶紫染色法观察生物膜形成的差异。结果dnaJ基因过表达组dnaJ基因相对表达量显著高于空质粒对照组,dnaJ基因过表达组24h生物膜量显著低于空质粒对照组(P<0.001)。结论过表达dnaJ基因对鲍曼不动杆菌生物膜形成能力有显著抑制作用。

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

【目的】建立一种能扩增dna J基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持。【方法】以弧菌dna J基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dna J基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性。【结果】优化后的PCR反应体系50.0μL:2×F8 Fast Long PCR Master Mix 25.0μL,上、下游引物(20μmol/L)各2.0μL,DNA模板5.0μL,灭菌水补足至50.0μL。扩增程序:94℃预变性3 min;94℃10 s,55℃15 s,72℃15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min。该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/m L。应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dna J基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dna J基因序列相似度为98.2%~99.9%。【结论】基于dna J基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dna J基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段。

猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达

为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列(NC_015153.1),应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。

胡萝卜体细胞胚DnaJ同源基因的分离及其表达特性分析

DuaJ/Hsp40蛋白是DnaK/Hsp70的辅助分子伴侣,它通过调节DnaK/Hsp70的ATPase活性来影响蛋白复合体的合成与组装。运用改进的cDNA代表性差示分析方法从解调控胡萝卜体细胞胚中分离出Dnal基因同源区段,进而以它为探针筛选解调控12h的胡萝卜体细胞胚cDNA文库,从胡萝卜中分离得到DuaJ蛋白同源基因DcJ1.序列分析表明它的编码区为1257bp,编码418个氨基酸和1个终止密码子,包含3个保守的特征结构域。Southern杂交分析表明,DcJ1基因在核基因组中以单拷贝或低拷贝形式存在;而Northern杂交则显示该基因仅在根中特异表达,其表达强度随着胡萝卜体细胞胚的调控-解调控过程发生明显的变化,并且不受热激的诱导。由此可见,DcJ1基因的表达活性与胡萝卜体细胞胚根的早期发育之间存在着明显的相关性。

家蚕DnaJ5基因的克隆与表达谱分析

DnaJ蛋白是一种调节蛋白。从构建的家蚕蛹cDNA文库中检索到一条编码DnaJ蛋白的EST,并克隆获得家蚕DnaJ5基因(Bm-DnaJ5,GenBank登录号为FJ592078)。该基因的开放阅读框长1 056 bp,编码351个氨基酸,分子质量为38.93 kD,等电点为9.25。利用实时定量PCR技术对Bm-DnaJ5基因在家蚕不同组织和发育时期的时空表达谱进行定量分析,结果显示:该基因在5龄幼虫时期的各组织中都有表达,在睾丸中的表达量最高,拷贝数达到1.16×108个/μg,其次在头部、中肠、前部丝腺和翅原基中的表达量也较高,在气管丛中的表达量最低,拷贝数仅为1.84×104个/μg;在蛹中期的几个组织中均有表达,其中在眼和睾丸中的表达量较高,拷贝数分别为8.79×107个/μg和1.78×107个/μg,而在卵巢中的表达量最低,拷贝数仅为1.94×105个/μg。

芸芥中DnaJ同源基因的克隆与表达分析

为研究芸芥自交亲和机理,采用mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析技术,从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得1条差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明,该差异片段与拟南芥DnaJ蛋白同源基因At J3有较高同源性,暂命名为esAtJ3基因。该序列含有一个长度为297 bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJ-C保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因编码的蛋白无信号肽,是一个亲水性蛋白,该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量PCR分析表明,esAtJ3基因在芸芥SC系开花前柱头中表达量较高,初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。