布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价

为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p<0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p>0.05),并且均显著高于PBS组(p<0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。

酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆和基因组步移技术克隆得到酸土脂环酸芽孢杆菌(DSM 3922T)DnaK基因全序列,其ORF全长1 854 bp,编码617个氨基酸,推测其氨基酸序列与来源于A.acidocaldarius LAA1的分子伴侣蛋白DnaK同源性最高,相似性达86%。利用同源建模对DnaK的二级结构和超二级结构的预测结果显示,该伴侣蛋白主要由α-螺旋和β-折叠组成,基本不含无规则卷曲,具有耐热蛋白质的特征。

可承载CETP多肽表位的颗粒样蛋白表达载体的克隆、表达与分离纯化

为了提高多肽表位的免疫原性,利用乙肝病毒核心抗原能够在体外自行组装成病毒样颗粒的特性,将人源胆固醇酯转运蛋白羧基端26个氨基酸连同大肠杆菌DnaK基因C端结构域克隆入乙肝病毒核心抗原的免疫优势决定区,并在大肠杆菌BL-21(DE3)表达,以包含体形式存在,经过洗涤、复性和分子筛纯化,获得纯度达90%以上的目的蛋白。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔后能够诱导产生高水平的抗胆固醇酯转运蛋白的抗体,表明乙肝病毒核心抗原能够在体外自发装配成多聚体颗粒,并能够将插入其免疫优势决定区的胆固醇酯转运蛋白(CETP)多肽表位展示于颗粒表面以提高免疫原性,显示出其作为疫苗免疫载体的良好前景。

赤红球菌SD3全基因组测序及其热休克蛋白DnaK的表达分析

红球菌属微生物因其自身较强的有机物耐受性和较宽的降解谱,能够适应多种生境而被广泛应用于生物脱硫、石油污染修复、有毒有机化合物降解、污水处理等领域。本研究利用单分子PacBio测序技术,对一株耐有机溶剂的赤红球菌SD3(Rhodococcus ruber SD3)全基因组进行测序并进行生物信息学分析。该菌株的全基因组长度大约为5.37 Mb,GC含量为70.63%,GenBank序列登录号为CP029146。使用Barrnap0.4.2和tRNAscan-SEv1.3.1软件对基因组中包含的rRNA基因和tRNA基因进行预测,发现有12个rRNA基因和53个tRNA基因。利用Glimmer3.02软件对该基因组进行基因预测,共得到5120个编码蛋白的基因。将预测的蛋白序列同时与KEGG、STRING和GO三类数据库进行Blastp比对,共计2836个蛋白基因获得COG功能注释,并且注释得到3130条GO功能条目和2190条KEGG通路条目。此外,基于荧光定量PCR的分析表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中热休克蛋白DnaK的表达分别上调了29.87倍和3.93倍。这些研究结果为赤红球菌的遗传改造和揭示赤红球菌的有机溶剂耐受性机制提供了理论依据。

滑液支原体DnaK的原核表达及免疫原性分析和亚细胞定位

参照GenBank中滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株dnaK基因序列(CP011096.1)设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-dnaK并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,进行SDS-PAGE分析。继而将纯化表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western-blot和免疫荧光试验对MS DnaK的免疫原性及其在细胞内的分布进行分析。结果显示,MS dna K基因全长1 791 bp,编码596个氨基酸,重组蛋白rMSDnaK在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,且其相对分子质量约为67 ku。间接ELISA和Western-blot结果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞浆和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量较多,免疫荧光试验进一步证实DnaK在MS膜表面的分布。本研究结果为进一步研究MS DnaK的生物学功能奠定了基础。

羊种布氏杆菌M5-90 DnaK的原核表达及免疫保护性研究

为对布氏杆菌DnaK基因的原核表达情况及免疫保护性进行分析,根据Gen Bank中公布的羊种布氏杆菌M5-90的DnaK基因序列,设计引物,合成DnaK基因片段,将其连接到p UC57载体测序;将DnaK基因克隆至原核表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌DE3感受态细胞中诱导表达;用SDS-PAGE凝胶电泳对DnaK融合蛋白进行分析;利用AKTAxpress智能多维纯化系统进行纯化;用Western-blot分析其反应原性。将DnaK融合蛋白免疫小鼠,利用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。结果显示,获得pET-28a-DnaK重组表达质粒,大约在69.8 ku处出现DnaK融合蛋白条带;纯化后条带单一;DnaK具有较好的反应原性;DnaK融合蛋白可诱导小鼠血清产生抗体IgG和细胞因子IFN-γ。结果表明,DnaK融合蛋白可作为候选亚单位疫苗。

沙门菌NASBA快速检测试剂的研制

目的:建立一种快速、简便的恒温核酸扩增(NASBA)方法。方法:用AMV RTase、RNase H、,T7 RNA聚合酶以及相应的缓冲成分组成的恒温扩增系统,对dnak基因RNA序列进行扩增。结果:经50 min反应后均可扩增出预期120pb大小的产物,第1次PCR产物经转录实验后与NASBA直接扩增的产物具有较好的同源性,其灵敏度达到103CFU。结论:NASBA法对沙门菌检测具有良好的特异性和灵敏度。